【微課堂】泰林壓力蒸汽滅菌生物指示劑芽孢計數(shù)方法

時間：2024/3/22

《藥品GMP指南》生物指示劑的應用中指出，實驗室在接收商品化生物指示劑時，應進行微生物數(shù)量測定。

那么壓力蒸汽滅菌生物指示劑的總芽孢數(shù)是如何確定的呢？接下來為大家分享泰林壓力蒸汽滅菌生物指示劑的芽孢計數(shù)方法（121℃滅菌生物指示劑均選用嗜熱脂肪地芽孢桿菌 Geobacillus stearothermoρhilus ATCC7953）。

隨機抽取需檢驗批次生物指示劑4片（支）與相關物品一并放入生物安全柜中，用酒精棉對指示劑初級包裝進行擦拭，通風15min以上，后續(xù)操作如下：

注意：物料準備過程中，切勿使用紫外照射生物指示劑，可能會導致計數(shù)結果偏低。

01 指示劑處理：

紙質(zhì)載體生物指示劑

將生物指示劑轉(zhuǎn)移至生物安全柜內(nèi)，取出載體，加入到含3~4顆4mm~6mm玻璃珠和3mL無菌水的試管中，置于渦旋混勻儀上充分振蕩，將試管中載體打散成纖維狀后，再加入7mL無菌水，制成均一的菌懸液，該試管記為10^-1（同步平行4片）。

懸液式生物指示劑

將懸液式生物指示劑（安瓿管式，規(guī)格：1mL/支）置于渦旋混勻儀上混勻，用安瓿開啟器打開安瓿管移取0.5mL菌懸液，置含4.5mL無菌水的試管中混勻，該試管記為10^-1。

將懸液式生物指示劑（直管式，規(guī)格：0.3mL/支），用直管切割器打開置于含9.7mL無菌水的試管中，置于渦旋振蕩儀上混勻，該試管記為10^-1。

02 熱激活處理

將上述10^-1試管放置于95℃～100℃恒溫水浴鍋中熱激活15min，熱激活結束后立即放入 0℃～4℃冰水混合浴中迅速冷卻至室溫。

03 梯度稀釋（10⁶濃度）

梯度稀釋操作流程圖（載體式示例）

注：根據(jù)生物指示劑總芽孢數(shù)適當調(diào)整稀釋級，建議最終稀釋芽孢數(shù)在30~300cfu/mL。

壓力蒸汽滅菌生物指示劑稀釋倍數(shù)對照表

04 培養(yǎng)計數(shù)

取最終稀釋的試管，用移液槍吸取1mL菌懸液加入90mm的一次性無菌平皿中，注入15mL ~20mL溫度不超過45 ℃融化的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA），混勻，每稀釋級至少制備2個平板。等待平板凝固后，倒置于恒溫培養(yǎng)箱中55℃~60℃培養(yǎng)24h~48h，記錄各平板的菌落數(shù)，并計算每片（支）生物指示劑的總芽孢數(shù)。