【??參數(shù)信息】
英文名稱：Annexin V-EGFP/PI Apoptosis Detection Kit
中文名稱：Annexin V-EGFP/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒
生產(chǎn)廠商：西安強(qiáng)化生物科技
【簡單概述】
Annexin V-EGFP/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（Annexin V-EGFP/PI Apoptosis Detection Kit）是一款用來檢測細(xì)胞凋亡的試劑盒，可以用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡進(jìn)行檢測。
本試劑盒包含融合增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）的Annexin V，用來檢測早期細(xì)胞凋亡；以及碘化丙啶（PI），用來檢測壞死細(xì)胞。
本試劑盒的工作原理在于：Phosphotidylserine是一種帶負(fù)電荷的磷脂。
正常細(xì)胞中，PS位于細(xì)胞膜內(nèi)面，但當(dāng)?shù)蛲鲩_始后，PS在磷脂雙分子層中的不對稱分布逐漸消失并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜表面，從而顯露在細(xì)胞外環(huán)境中。
膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）是一種分子量約35kDa的鈣離子依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能非常容易的結(jié)合PS，且具有高度的親和性。
因此，通過Annexin V與PS的結(jié)合與否來判斷凋亡發(fā)生。
另外，PI的引入能輔助區(qū)分凋亡早期細(xì)胞和晚期凋亡或壞死細(xì)胞。
PI作為一種活細(xì)胞排斥探針，不能穿透具有完整細(xì)胞膜的正常細(xì)胞或凋亡早期細(xì)胞，但能穿透喪失細(xì)胞膜完整性的凋亡晚期細(xì)胞或壞死細(xì)胞，從而將細(xì)胞核染紅。
因此，將Annexin V-EGFP與PI聯(lián)合使用時(shí)，呈現(xiàn)結(jié)果為：正常細(xì)胞，早期凋亡細(xì)胞；晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞同時(shí)呈現(xiàn)雙陽性。
【染色步驟】
小心收集細(xì)胞培養(yǎng)液到一干凈離心管內(nèi)備用。
用不含EDTA的yi酶消化細(xì)胞至細(xì)胞可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下來時(shí)，加入前面收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打下所有的貼壁細(xì)胞，并輕輕吹散細(xì)胞。
再次收集到離心管內(nèi)。1000rpm離心5min，沉淀細(xì)胞。
對于特定的細(xì)胞，如果無法離心至管底，可以適當(dāng)延長離心時(shí)間或稍稍加大離心速度。
小心吸除上清，可以殘留約50µl左右的培養(yǎng)液，以避免吸走細(xì)胞。
加入1ml 4℃預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，再次離心沉淀細(xì)胞，小心吸除上清。
對于特定的細(xì)胞，如果無法離心至管底，可以適當(dāng)延長離心時(shí)間或稍稍加大離心速度。
小心吸除上清，可以殘留約50µl左右的培養(yǎng)液，以避免吸走細(xì)胞。
加入1ml 4℃預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，再次離心沉淀細(xì)胞，小心吸除上清。
（2）用去離子水按照1:3稀釋結(jié)合緩沖液到1×，比如，5ml結(jié)合緩沖液（4×）加入15ml去離子水。
（3）用結(jié)合緩沖液（1×）重新懸浮細(xì)胞并調(diào)整濃度為1-5×106/ml。
（4）取100µl的細(xì)胞懸液到5ml流式管中，加入5µl Annexin V-EGFP混勻，室溫避光孵育5min。
（5）再加入10µl碘化丙啶溶液，并加400µl結(jié)合緩沖液（1×），混勻，盡快（＜1h）用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡完成檢測。
方便起見，步驟1.4內(nèi)可同時(shí)加入5µl Annexin V-EGFP和10µl碘化丙啶溶液混勻，室溫避光孵育5min。
然后加入400µl結(jié)合緩沖液（1×）混勻，但需盡快（＜1h）用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡完成檢測。
但為了減少實(shí)驗(yàn)誤差，建議按照1.4-1.5的步驟來操作。
因PI受時(shí)間影響比較大，細(xì)胞標(biāo)記上PI后毒性會(huì)增加。
隨著時(shí)間延長會(huì)導(dǎo)致PI染色增加，尤其是檢測早期凋亡時(shí)，誤差會(huì)明顯加大。
【相關(guān)試劑】
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本試劑僅適用于科研實(shí)驗(yàn)，敬請知悉。
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