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pGBKT7-53 Vector 酵母雙雜交對照載體

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參考價:￥500 - ￥15000 /mg

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更新時間：2025-08-25 08:41:00瀏覽次數(shù)：320次

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西安強化生物科技有限公司

經(jīng)營模式：生產(chǎn)廠家

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所在地區(qū)：陜西西安市

聯(lián)系人：李杰（經(jīng)理）

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產(chǎn)品簡介

pGBKT7-53 Vector 酵母雙雜交對照載體，是酵母雙雜交系統(tǒng)的陽性對照載體，表達GAL4 DNA結(jié)合域與小鼠p53蛋白的融合蛋白，用于驗證系統(tǒng)可靠性，含c-Myc標簽和TRP1篩選標記?！?/p>

詳細介紹

【??參數(shù)信息】

英文名稱：pGBKT7-53 Vector 酵母雙雜交對照載體

載體類型：酵母雙雜交系統(tǒng)載體

克隆菌株：DH5α

載體標簽：c-Myc

篩選標記：TRP1

啟動子：ADH1

表達宿主：酵母細胞

5'測序引物：T7: TAATACGACTCACTATAGGG

3'測序引物：根據(jù)序列設(shè)計引物

純度：≥95%

儲存條件：-20℃避光干燥

生產(chǎn)廠商：西安強化生物科技

【簡單概述】

pGBKT7-53 Vector 酵母雙雜交對照載體，其核心功能是表達 GAL4 DNA 結(jié)合域（DNA-BD）與小鼠p53 蛋白片段的融合蛋白，用于驗證酵母雙雜交系統(tǒng)的可靠性。

關(guān)鍵特征

載體結(jié)構(gòu)

融合蛋白組成：

GAL4 DNA-BD（氨基酸 1-147）：負責(zé)結(jié)合靶基因啟動子。

小鼠 p53 蛋白（氨基酸 72-390）：已知與 SV40 大 T 抗原相互作用的腫瘤抑制蛋白。

啟動子：ADH1 啟動子驅(qū)動融合蛋白的高水平表達。

標簽：c-Myc 表位標簽，便于抗體檢測。

克隆位點：p53 cDNA 插入 EcoRI 和 BamHI 位點之間。

載體參數(shù)

大?。?.3 kb或 8275 bp。

抗性基因：

原核抗性：Kanamycin。

真核篩選標記：TRP1。

復(fù)制子：

pUC ori（大腸桿菌復(fù)制起點）。

2μ ori（酵母復(fù)制起點）。

來源

p53 cDNA 源自 Lwabuchi 等（1993）描述的質(zhì)粒，經(jīng) Clontech 改造。。

【使用方法】

一、載體特性與用途

載體本質(zhì)：

編碼 GAL4 DNA結(jié)合域（BD, 1-147aa）與小鼠p53蛋白（72-390aa）的融合蛋白，用于模擬已知蛋白質(zhì)相互作用（如p53與SV40大T抗原）。

作為陽性對照，驗證酵母雙雜交系統(tǒng)的可靠性（例如：當與pGADT7-T共轉(zhuǎn)化時，應(yīng)激活報告基因）。

二、實驗步驟

（一）載體準備

質(zhì)粒溶解：

收到凍干粉后，5000 rpm離心1分鐘，加入20 μl無菌水重懸，室溫放置1分鐘。

測定濃度（建議≥100 ng/μl），保存于-20℃。

質(zhì)粒轉(zhuǎn)化（大腸桿菌）：

將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至 DH5α 等感受態(tài)細胞，37℃培養(yǎng)，Kan（50 μg/ml）篩選。

挑取單菌落擴增，提取高純度質(zhì)粒備用（避免直接使用凍干粉）。

（二）酵母轉(zhuǎn)化與對照實驗

酵母感受態(tài)制備：

使用 Y2HGold 或 AH109 等標準酵母菌株，制備感受態(tài)細胞（如LiAc/PEG法）。

共轉(zhuǎn)化（陽性對照設(shè)置）：

實驗組：pGBKT7-53（誘餌） + pGADT7-T（獵物，編碼SV40 T抗原）。

陰性對照：

pGBKT7-53 + 空pGADT7載體

pGBKT7-Lam（編碼Lamin C，無互作） + pGADT7-T。

轉(zhuǎn)化操作：

將質(zhì)粒（0.1–1 μg）與感受態(tài)酵母混合，熱激（42℃, 15分鐘），涂布于 SD/-Trp 平板（篩選pGBKT7-53轉(zhuǎn)化子）。

30℃培養(yǎng)3–5天，挑取直徑≥2 mm的單菌落。

（三）自激活與毒性檢測（關(guān)鍵質(zhì)控）

自激活測試：

將含pGBKT7-53的酵母菌落接種至：

SD/-Trp（基礎(chǔ)篩選）

SD/-Trp/-His/X-α-Gal（或 QDO/X/A 培養(yǎng)基）。

若在缺陷培養(yǎng)基上生長并顯藍色（報告基因激活），說明p53融合蛋白可能自激活，需調(diào)整3AT濃度抑制。

毒性檢測：

比較轉(zhuǎn)化子與空載體對照的生長速度，若生長延遲則提示蛋白毒性。

（四）互作篩選（以篩庫為例）

交配法（Mating）：

將含pGBKT7-53的 Y2HGold 菌株與含文庫（pGADT7-XXX）的 Y187 菌株混合，30℃培養(yǎng)24–48小時。

涂布于 DDO（SD/-Leu/-Trp）和 QDO（SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal）平板，篩選陽性克?。≦DO上生長且顯藍）。

陽性克隆驗證：

菌落PCR：使用載體特異性引物（如T7啟動子引物）擴增插入片段。

測序鑒定：排除重復(fù)克隆，比對序列確認互作蛋白。

點對點驗證：將候選獵物質(zhì)粒與pGBKT7-53再次共轉(zhuǎn)化，重復(fù)互作實驗。

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本試劑僅適用于科研實驗，敬請知悉。

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pGBKT7-53 Vector 酵母雙雜交對照載體