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pGBKT7-Lam Vector 酵母雙雜交對照載體

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參考價:￥500 - ￥15000 /mg

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更新時間：2025-08-22 08:41:59瀏覽次數(shù)：228次

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  熒光染料

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鬼筆環(huán)肽

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膜聯(lián)蛋白

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西安強化生物科技有限公司

經(jīng)營模式：生產(chǎn)廠家

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所在地區(qū)：陜西西安市

聯(lián)系人：李杰（經(jīng)理）

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產(chǎn)品簡介

pGBKT7-Lam Vector 酵母雙雜交對照載體，表達Lamin C與GAL4 DNA結(jié)合域的融合蛋白，含c-Myc標(biāo)簽，適用于假陽性檢測和實驗標(biāo)準(zhǔn)化。

詳細介紹

【??參數(shù)信息】

英文名稱：pGBKT7-Lam Vector 酵母雙雜交對照載體

載體類型：酵母雙雜交系統(tǒng)載體

載體大?。?.9kb

原核抗性：Kanamycin, Kan

克隆菌株：DH5α

載體標(biāo)簽：c-Myc

篩選標(biāo)記：TRP1

啟動子：ADH1

表達宿主：酵母細胞

5'測序引物：T7: TAATACGACTCACTATAGGG

3'測序引物：根據(jù)序列設(shè)計引物

純度：≥95%

儲存條件：-20℃避光干燥

生產(chǎn)廠商：西安強化生物科技

【簡單概述】

pGBKT7-Lam是一種用于酵母雙雜交系統(tǒng)的陰性對照載體，由基礎(chǔ)載體pGBKT7改造而來。

pGBKT7-Lam Vector 酵母雙雜交對照載體其核心特征包括：

結(jié)構(gòu)組成：

表達人核纖層蛋白C（Lamin C）與GAL4 DNA結(jié)合域（DNA-BD）的融合蛋白，其中Lamin C包含66–230位氨基酸片段，DNA-BD包含1–147位氨基酸片段。

含c-Myc表位標(biāo)簽，便于融合蛋白的免疫檢測。

啟動子系統(tǒng)：ADH1啟動子驅(qū)動融合蛋白在酵母細胞內(nèi)表達；T7啟動子支持體外轉(zhuǎn)錄翻譯。

抗性標(biāo)記：原核宿主（如大腸桿菌）使用KanR，真核宿主（酵母）使用TRP1營養(yǎng)篩選標(biāo)記。

復(fù)制原點：2μ ori（酵母）和pUC ori（大腸桿菌），支持雙宿主復(fù)制。

載體大?。?.9 kb（含插入片段）。

設(shè)計目的：

作為酵母雙雜交實驗的標(biāo)準(zhǔn)化陰性對照，用于檢測假陽性相互作用背景。

【實驗步驟】

（一）載體轉(zhuǎn)化與質(zhì)粒擴增（大腸桿菌）

感受態(tài)準(zhǔn)備：使用DH5α等克隆菌株，冰上解凍感受態(tài)細胞。

轉(zhuǎn)化：

取2μl質(zhì)粒加入100μl感受態(tài)細胞，冰浴30分鐘。

42℃熱激90秒，冰浴2分鐘。

加入900μl無抗LB培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)45分鐘。

離心（6000 rpm, 5分鐘）后重懸菌體，涂布于含卡na霉素（50μg/ml）的LB平板。

驗證：挑取單克隆擴增后，通過酶切（如BamHI/PstI）或測序（引物T7 Forward）確認載體正確性。

（二）酵母轉(zhuǎn)化（酵母雙雜交系統(tǒng)）

酵母菌株：常用Y2HGold、AH109等。

共轉(zhuǎn)化要求：

陰性對照設(shè)置：需與pGADT7-T（或空pGADT7）共轉(zhuǎn)化，形成完整對照系統(tǒng)。

陽性對照：pGBKT7-53 + pGADT7-T（驗證系統(tǒng)有效性）。

轉(zhuǎn)化步驟：

制備酵母感受態(tài)細胞（如LiAc/PEG法）。

加入pGBKT7-Lam及配對載體（如pGADT7-T），冰浴30分鐘。

42℃熱激15分鐘，涂布于SD/-Trp/-Leu（DDO）平板篩選共轉(zhuǎn)化子。

（三）陰性對照驗證實驗

培養(yǎng)基篩選：

將共轉(zhuǎn)化酵母接種至四缺培養(yǎng)基（SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp，即QDO），添加X-α-gal（顯色劑）和3-AT（抑制弱自激活）。

預(yù)期結(jié)果：

無生長（或微弱生長）：表明無假陽性相互作用。

無藍色顯色：排除報告基因（如MEL1）激活。

自激活檢測：若pGBKT7-Lam單獨轉(zhuǎn)化酵母后在QDO/X平板上生長，需優(yōu)化3-AT濃度抑制自激活。

（四）結(jié)果分析與注意事項

假陽性排查：若陰性對照在QDO/X/A培養(yǎng)基生長，需檢查載體構(gòu)建是否污染或?qū)嶒灢僮髡`差。

毒性檢測：觀察酵母菌落大小，若顯著小于陽性對照，提示融合蛋白可能有毒性。

保存：轉(zhuǎn)化成功的酵母菌株可加甘油凍存于-80℃。

【相關(guān)試劑】

DAF-FM DA (5mM in DMSO)

Sodium Nitroprusside(SNP)

S-Nitrosoglutathione(GSNO)

K599 Chemically Competent Cell

K599 Electrocompetent Cell

Ar A4 Chemically Competent Cell

Ar A4 Electrocompetent Cell

Ar Qual Chemically Competent Cell

Ar Qual Electrocompetent Cell

Ar 1193 Chemically Competent Cell

ER-TrackerTM Blue-White DPX, for live-cell imaging

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本試劑僅適用于科研實驗，敬請知悉。

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pGBKT7-Lam Vector 酵母雙雜交對照載體