產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

     本產(chǎn)品miRNA鏈合成試劑盒采用Poly(A)加尾法原理，首先在miRNA 3’末端加Poly(A)尾，再使用 Anchored oligo(dT)-universal tag 通用逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下生成 miRNA 對(duì)應(yīng)的鏈cDNA。本產(chǎn)品使用特殊優(yōu)化預(yù)混合 miRNA RT Enzyme Mix 將 Poly(A)加尾和逆轉(zhuǎn)錄合并為一步完成，大大簡(jiǎn)化了操作步驟并提高 Poly(A)加尾和逆轉(zhuǎn)錄效率， 本產(chǎn)品可從20pg-2μg 的 Total RNA 中有效制備 miRNA 對(duì)應(yīng)的鏈cDNA。

產(chǎn)品用途

用于miRNA對(duì)應(yīng)cDNA鏈的合成。本產(chǎn)品可從20pg-2μg 的 Total RNA 中有效制備 miRNA的cDNA。

本產(chǎn)品需與HRbio™ miRNA qPCR Kit miRNA熒光定量PCR試劑盒配套使用。

產(chǎn)品組分

運(yùn)輸和保存方法

干冰運(yùn)輸。-20℃保存，避免反復(fù)凍融，有效期1年。

使用方法

miRNA 3’末端進(jìn)行Poly (A)加尾和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（鏈合成）

1.解凍2×miRNA RT Reaction Mix并混勻，miRT Enzyme Mix放于冰中備用，加入以下試劑至總體積20μl(注意：最后加入miRNA RT Enzyme Mix)

2.移液器輕輕混勻上述配制的反應(yīng)液，短暫離心后在42°C反應(yīng)60 min。

3.85°C加熱5秒鐘失活miRNA RT Enzyme Mix。

4.合成的cDNA反應(yīng)液可放置于-20°C保存；也可以直接進(jìn)行下游PCR或者熒光定量PCR檢測(cè)。

miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(加尾法）

注意事項(xiàng)

1）miRNA RT Enzyme Mix比較粘稠，溶液容易吸附在管壁和吸頭外導(dǎo)致?lián)p失，用前請(qǐng)點(diǎn)甩離心，并且避免吸頭外壁沾附損失。Enzyme Mix內(nèi)酶都是過(guò)量的，即使每次按照 1.8μl使用，也不影響使用效果。

2）在反應(yīng)中使用的total RNA 必須包含有小分子RNA(miRNA)。此過(guò)程也可以使用富集的miRNA， 單純miRNA無(wú)法直接用分光光度計(jì)定量，建議直接加入2μl ~5μl?？筛鶕?jù)目的miRNA豐度決定加入量，但是對(duì)于低豐度miRNA 樣品而言(如血清血漿提取物)，可直接加入體積8 μl。

3）按照上述操作步驟得到的cDNA模板用于下游PCR或者熒光定量PCR檢測(cè)時(shí)，可以根據(jù)實(shí)際情況選擇使用量，對(duì)于特殊的檢測(cè)體系中，高含量的cDNA 模板易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，可根據(jù)所檢測(cè)miRNA 的豐度適當(dāng)?shù)南♂宑DNA（5-10倍或者100倍）后使用。如果發(fā)現(xiàn)有非特異擴(kuò)增條帶，或者溶解曲線(xiàn)顯示有非特異擴(kuò)增，往往提示cDNA模板過(guò)量， 可以嘗試將上述cDNA模板稀釋幾十到幾百倍甚至上千倍再使用。

4）本產(chǎn)品僅作科研用途！