ELISA實驗| 操作材料儀器、步驟、注意事項、常見問題

　　ELISA實驗材料與儀器

　　試劑?：96孔酶標板、特異性包被抗體/抗原、HRP標記二抗、樣本稀釋液、PBST洗滌液、1% BSA封閉液、TMB顯色液、終止液、梯度標準品

　　實驗儀器?：單/多道校準移液器、恒溫培養(yǎng)箱、酶標儀、洗板機(或手工洗板耗材)、離心機、4℃/-20℃冰箱、pH計

　　輔助耗材?：無酶槍頭、封板膜、吸水紙、離心管、一次性手套

　　標準操作步驟(以雙抗體夾心法為例)

　　包被封閉?：用pH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋捕獲抗體，每孔加100μL，4℃過夜包被;PBST洗3次后，每孔加150μL 1% BSA，37℃封閉1小時

　　樣本孵育?：棄封閉液洗3次，每孔加100μL梯度標準品/預處理樣本，封板后37℃孵育1-2小時

　　洗板加酶標抗體?：棄液洗3-5次拍干，每孔加100μL稀釋后的酶標二抗，37℃避光孵育30-60分鐘

　　顯色終止?：再次充分洗板拍干，每孔加100μL TMB底物，37℃避光顯色10-15分鐘;每孔加50μL終止液終止反應

　　讀值分析?：15分鐘內(nèi)用酶標儀在450nm波長下測定OD值，通過標準曲線計算樣本中目標物濃度

　　關(guān)鍵操作注意事項

　　樣本處理?：血清避免溶血、細菌污染，短期4℃保存不超過5天，長期分裝-20℃凍存，嚴禁反復凍融

　　試劑管控?：所有試劑實驗前室溫平衡30分鐘，不同批次試劑不可混用，顯色液現(xiàn)配現(xiàn)用避免光照分解

　　操作細節(jié)?：加樣垂直加至孔底中央，避免觸碰孔壁;洗板每孔注液≥300μL，浸泡30秒以上，拍干無殘留

　　溫育控制?：嚴格把控37℃溫育時間，酶標板加蓋封板膜，避免液體蒸發(fā)，禁止疊放酶標板保證溫度均勻

　　常見問題與解決方案

　　整板不顯色/顯色過淺?：核對是否漏加酶標抗體/顯色液，確認試劑盒未過期，適當延長孵育時間

　　背景過高/花板?：增加洗板次數(shù)延長浸泡時間，更換被污染的底物試劑，提高封閉液濃度延長封閉時長

　　標準曲線擬合差?：標準品避免反復凍融，提前校準移液器，梯度稀釋時每步充分混勻

　　數(shù)據(jù)重復性差?：同一實驗單人操作避免加樣誤差，孵育時減少恒溫箱開門次數(shù)，樣本使用前充分渦旋混勻

　　注：以上科研產(chǎn)品資料供參考!

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