使用大鼠ELISA試劑盒進(jìn)行實驗需遵循哪些操作流程

　　大鼠ELISA試劑盒實驗需遵循?從樣本準(zhǔn)備到結(jié)果計算?的標(biāo)準(zhǔn)化流程，全程操作可分為5個核心階段，具體步驟如下：

　　一、實驗前期準(zhǔn)備

　　樣本制備?(根據(jù)不同樣本類型處理)

　　血清?：全血室溫靜置2小時或4℃過夜，1000×g離心20分鐘，取上清檢測;

　　血漿?：推薦EDTA-Na?抗凝，采集后30分鐘內(nèi)1000×g離心15分鐘，取上清，避免溶血、高血脂樣本;

　　組織勻漿?：預(yù)冷PBS沖洗去血，稱重剪碎后按1:9(g/mL)加PBS冰上研磨，超聲破碎或反復(fù)凍融后，5000×g離心5~10分鐘取上清;

　　所有樣本1周內(nèi)檢測可4℃保存，長期需分裝凍存于-20℃(1個月內(nèi))或-80℃(6個月內(nèi))，嚴(yán)禁反復(fù)凍融;濃度超標(biāo)需提前稀釋，建議預(yù)實驗確定稀釋倍數(shù)。

　　試劑平衡?：天正信達(dá)試劑盒取出后室溫放置30分鐘，所有試劑恢復(fù)至室溫后使用，剩余未用板條密封后2~8℃保存。

　　洗滌液配制?：通常為20~30倍濃縮液，按說明書比例用蒸餾水稀釋后備用。

　　二、加樣與溫育

　　分別設(shè)置?空白孔?(僅加樣品稀釋液，不加樣本和酶標(biāo)試劑)、?標(biāo)準(zhǔn)品孔?、?待測樣本孔?;

　　標(biāo)準(zhǔn)品稀釋：按說明書梯度稀釋(一般為5個濃度梯度，例如12ng/L、8ng/L、4ng/L、2ng/L、1ng/L)，每孔加50~100μl稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品;

　　待測樣本孔：先加40μl樣品稀釋液，再加10μl待測樣本(終稀釋度為5倍)，加樣時避免觸碰孔壁，輕輕晃動混勻;

　　封板膜封板后，37℃溫育30分鐘(若為一步法試劑盒，溫育時間延長至60分鐘)。

　　三、洗滌與加酶

　　溫育結(jié)束后揭掉封板膜，棄去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液靜置30秒后棄去，重復(fù)洗滌5次，最后在吸水紙上拍干;

　　除空白孔外，每孔加入50~100μl酶標(biāo)試劑，再次封板，37℃溫育30分鐘。

　　四、顯色與終止

　　重復(fù)洗滌步驟5次拍干后，每孔先加50μl顯色劑A液，再加50μl顯色劑B液，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10~15分鐘(顯色時間可根據(jù)顏色梯度適當(dāng)調(diào)整);

　　顯色完成后，每孔加50μl終止液，終止反應(yīng)(此時藍(lán)色會立即轉(zhuǎn)為黃色)。

　　五、讀數(shù)與結(jié)果計算

　　以空白孔調(diào)零，在終止反應(yīng)后15分鐘內(nèi)，用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定各孔吸光度(OD值)，可搭配630nm參比波長校正誤差;

　　以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣本吸光度計算濃度，最后乘以樣本稀釋倍數(shù)，得到最終檢測結(jié)果。

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