本生大課堂——ELISA實(shí)驗(yàn)可能出現(xiàn)的問(wèn)題及原因分析

　　1.應(yīng)該注意試劑4°c冷藏時(shí)水化層形成，蛋白分子分布異常;

　　2.標(biāo)本由于冷藏時(shí)Ig G聚合成多聚體，F(xiàn)ib非特異性吸附，反復(fù)凍融機(jī)械切力致使蛋白分子受損;

　　3.加樣時(shí)不準(zhǔn)，槍頭吸樣時(shí)插入樣本液面下2mm為宜;

　　4.常采用的溫度有43、37°c、室溫、或者4°c等。37°c常用，4°c效果好，但孵育時(shí)間有異;

　　5.要注意內(nèi)源如風(fēng)濕因子，補(bǔ)體，高濃度非特異性免疫球蛋白，異嗜性抗體及某些自身抗體等;外源如標(biāo)本溶血，細(xì)菌污染，儲(chǔ)存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)及凝固等因素影響。

　　6、在使用ELISA試劑盒時(shí)應(yīng)注意：2-8℃保存(特殊情況除外)、同一品種不同批號(hào)試劑不能混用、不同品種試劑盒顯色劑不能混用。

　　常見(jiàn)問(wèn)題及分析

　　1、陽(yáng)性對(duì)照不顯色

　　漏加陽(yáng)性對(duì)照

　　陽(yáng)性對(duì)照孔忘加酶或忘加顯色劑

　　陽(yáng)性對(duì)照受污染

　　2、陽(yáng)性對(duì)照顯色淺

　　試劑和保存不當(dāng)、活性下降

　　在使用前試劑盒未放置在室溫平衡

　　溫育時(shí)間不夠或孵育溫度過(guò)低

　　洗板浸泡時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、洗板次數(shù)過(guò)多

　　使用不正確的洗液

　　洗液中含有防腐劑同時(shí)殘留量過(guò)多

　　洗板后酶標(biāo)板被干透

　　讀數(shù)時(shí)使用波長(zhǎng)不正確

　　濾光片不清潔或?yàn)V光片位置錯(cuò)誤

　　讀數(shù)時(shí)酶標(biāo)板放置位置錯(cuò)誤

　　陽(yáng)性對(duì)照活性下降

　　酶標(biāo)失活

　　3、陰性對(duì)照顯色

　　實(shí)驗(yàn)過(guò)程受污染

　　陰性對(duì)照污染

　　酶滴在孔壁上

　　4、整板不顯色

　　試劑和保存不當(dāng)、已經(jīng)失活

　　忘記加酶、可檢查滴瓶?jī)?nèi)酶量

　　忘記加抗原或中和試劑

　　忘記加顯色劑A或顯色劑B

　　5、陽(yáng)性對(duì)照讀數(shù)不正常

　　加入標(biāo)本后未進(jìn)行必要的混勻

　　標(biāo)本稀釋錯(cuò)誤

　　加樣量不正確

　　冷凍標(biāo)本未溶解混勻

　　標(biāo)本中含有防腐劑

　　6、血清本底高

　　試劑盒靈敏度高

　　加樣時(shí)使用同一槍頭、交叉污染

　　孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或溫度過(guò)高

　　洗板次數(shù)不足，浸泡時(shí)間短

　　洗板時(shí)洗液量少或殘留量多

　　洗板時(shí)洗液量過(guò)多、串孔

　　洗板機(jī)管道中有霉菌生長(zhǎng)

　　洗液瓶混用

　　洗板機(jī)洗板頭阻塞或洗板機(jī)洗板頭位置錯(cuò)誤

　　配置洗液的去離子水或蒸餾水被污染

　　終止液濃度不夠，沒(méi)有充分混勻，或終止液被污染

　　讀數(shù)時(shí)酶標(biāo)板底部有水蒸氣凝結(jié)

　　酶標(biāo)儀偏差

　　7、假陽(yáng)性結(jié)果

　　實(shí)驗(yàn)器具被污染

　　血清中出現(xiàn)纖維蛋白凝集

　　血清標(biāo)本中出現(xiàn)過(guò)多的紅細(xì)胞

　　血漿標(biāo)本處理不當(dāng)

　　標(biāo)本中含有灰塵、顆?；蚣?xì)菌等

　　標(biāo)本被反復(fù)凍融

　　加標(biāo)本后進(jìn)行不正確的振蕩

　　沿孔壁上加入標(biāo)本，加樣后出現(xiàn)過(guò)多的氣泡

　　酶標(biāo)滴加在孔壁上，洗板未洗凈

　　混用洗液或洗液稀釋錯(cuò)誤

　　洗液瓶中、管道或配置洗液的水中有霉菌

　　洗板次數(shù)不足或浸泡時(shí)間短

　　洗板時(shí)洗液量少或殘留量多

　　洗板時(shí)洗液量過(guò)多、串孔

　　讀數(shù)時(shí)酶標(biāo)板底部有水蒸氣凝結(jié)

　　洗液瓶、廢液瓶混用

　　讀數(shù)過(guò)程中板孔中有氣泡

　　酶標(biāo)儀偏差

　　8、同一板內(nèi)重復(fù)性差

　　標(biāo)本混勻不充分

　　試劑混勻不充分

　　標(biāo)本與酶結(jié)合物混勻不充分

　　加樣技術(shù)差異

　　加樣器故障或加樣器被污染

　　加樣時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致孵育時(shí)間不同

　　孵育器內(nèi)部的溫度不一致，造成酶標(biāo)板孔間的孵育溫度差異

　　讀數(shù)時(shí)酶標(biāo)板孔間有氣泡

　　注：以上供參考！

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