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還在為ELISA實(shí)驗(yàn)的繁瑣步驟頭疼？為標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合不佳而焦慮？或是在抗體選擇和樣品處理上頻頻踩坑？

酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）作為免疫學(xué)領(lǐng)域的"金標(biāo)準(zhǔn)"技術(shù)，憑借其皮克級(jí)（pg/mL）的超高靈敏度，早已成為基礎(chǔ)研究、臨床診斷和生物制藥的工具。在直接法、間接法、夾心法、競爭法等多種類型中，雙抗夾心法以其特異性和靈敏度脫穎而出，成為科研工作者常用的檢測方案。

「ELISA問診室」義翹神州將帶你從零開始，完整拆解雙抗夾心ELISA的實(shí)驗(yàn)原理、操作流程及避坑指南。無論你是初次接觸的新手，還是希望優(yōu)化實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)的進(jìn)階者，這份保姆級(jí)教程都值得收藏轉(zhuǎn)發(fā)。

一、雙抗夾心ELISA實(shí)驗(yàn)原理

理解原理是做好實(shí)驗(yàn)的一步。雙抗夾心法的核心機(jī)制可以形象概括為"三明治"結(jié)構(gòu)——兩種抗體像面包片一樣"夾"住中間的抗原。

具體而言，首先將捕獲抗體包被在固相載體（如96孔板）上，加入待測樣品后，目標(biāo)抗原被特異性"捕獲"。經(jīng)過洗滌去除雜質(zhì)，再加入檢測抗體結(jié)合抗原的另一個(gè)表位，形成"捕獲抗體-抗原-檢測抗體"的復(fù)合物。最后加入酶底物（如HRP-TMB體系），通過顯色反應(yīng)的顏色深淺實(shí)現(xiàn)定量分析。

· 捕獲抗體（Capture Antibody）：固定在孔板底部，特異性結(jié)合目標(biāo)抗原。

· 檢測抗體（Detection Antibody）：識(shí)別并結(jié)合抗原的另一個(gè)非重疊表位。檢測抗體通常與酶（如HRP或堿性磷酸酶）偶聯(lián)，或者通過間接結(jié)合二抗進(jìn)行檢測。

· 顯色反應(yīng)：常用HRP-TMB顯色體系。底物TMB在過氧化物酶HRP催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，通過酸終止反應(yīng)變成黃色。終止反應(yīng)后在酶標(biāo)儀上測光密度（OD）值。顏色的深淺與樣品中的蛋白質(zhì)呈正相關(guān)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品OD值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算樣品中抗原的含量。

二、樣品處理及凍存

掌握原理后，規(guī)范的樣品處理是確保數(shù)據(jù)可靠性的前提。

雙抗夾心法可檢測樣本范圍十分廣泛，如血液（血清、血漿）、組織勻漿或提取物、細(xì)胞培養(yǎng)上清、細(xì)胞裂解液、分泌物（唾液、乳汁）、排泄物（尿液、大便）等。

血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管收集血液，1000 g離心10min，將血清和紅細(xì)胞迅速小心的分離。

血漿：1000 g離心30min，取上清。凝血?jiǎng)┲械腅DTA、檸檬酸鹽、肝素等可直接用于檢測。

細(xì)胞培養(yǎng)上清：1000 g離心10min，取上清。

組織勻漿：加入適量生理鹽水搗碎。1000 g離心10min，取上清。

處理后的樣品如果不立即使用，應(yīng)將其分成小份，于-70℃保存，避免反復(fù)冷凍。凍存樣品不能在37℃或更高溫度加熱解凍，應(yīng)在室溫（22-28℃）下進(jìn)行，并確保樣品均勻、充分解凍。

以上部分是常用樣品的快速簡便處理方案，僅供參考。

三、雙抗夾心法操作步驟

1）準(zhǔn)備酶標(biāo)板

在實(shí)驗(yàn)開始前，應(yīng)將本次實(shí)驗(yàn)所使用的試劑置于室溫（22-28℃）平衡30分鐘以上。如果緩沖液中有晶體形成，可延長室溫平衡時(shí)間，期間輕輕搖晃至晶體全部溶解。

Tips：試劑不能直接在37℃平衡。試劑或樣品稀釋時(shí)確?；靹颍M量減少氣泡。

如果是購買的商品化ELISA試劑盒，需確定測定的孔數(shù)。對(duì)于可拆酶標(biāo)條，請(qǐng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的條數(shù)。將未使用的酶標(biāo)條從板框上取下，放回鋁箔袋中，重新密封好。

商品化試劑盒一般已包被捕獲抗體，可直接使用。在每孔中加入300μL 1×洗劑液，室溫靜置2min。棄掉洗劑液，并在吸水紙上將板孔拍干。重復(fù)2次。

Tips：浸泡洗板完成后，請(qǐng)立即使用酶標(biāo)板，不用讓其干燥。

如果是自己開發(fā)雙抗夾心ELISA，還需要進(jìn)行捕獲抗體包被操作：

① 包被：用碳酸鹽或磷酸鹽緩沖液按比例將捕獲抗體稀釋到一定濃度，每孔加入100μL，37℃ 2h或者4℃過夜。

② 洗板：棄孔內(nèi)液體，甩干。每孔加300-350μL 10mM PBST（含0.05% Tween-20），浸泡1-2min，在吸水紙上將板孔拍干。重復(fù)2次。

③ 封閉：每孔加300-350μL封閉液，封閉液為10mM PBST中添加1% BSA或5% 脫脂牛奶。37℃孵育2h。

④ 洗板：同步驟②

2）孵育樣品和標(biāo)準(zhǔn)品

⑤ 每孔中加入100μL 樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，蓋上或密封板子，室溫下孵育2h。

2倍倍比法稀釋標(biāo)準(zhǔn)品：首先制備濃度最-高的標(biāo)準(zhǔn)品，如取20μL 濃度為50ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，加入980μL 1×稀釋緩沖液，制成1000μL 1ng/mL的最-高濃度標(biāo)準(zhǔn)品。然后將其進(jìn)行六次2倍稀釋，取6支新的試管，每管中加入500μL 1×稀釋緩沖液，第-一個(gè)試管中加入500μL最-高濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，充分混勻后，從第-一個(gè)試管中吸取500μL液體加入到第二個(gè)試管中，依次類推。

空白孔中一般加入100μL 1×稀釋緩沖液。如果是細(xì)胞培養(yǎng)物上清，也可以加入100μL的培養(yǎng)基。

Tips：標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液要現(xiàn)用現(xiàn)配。樣品和標(biāo)準(zhǔn)品要在同一塊酶標(biāo)板上孵育，不要分開操作。

⑥ 洗板：棄掉液體，每孔加入300μL 1×洗滌緩沖液，靜置約1-2min。吸出或傾倒液體并在紙巾上拍干。重復(fù)洗板3次。

Tips：為獲得理想實(shí)驗(yàn)結(jié)果，必須移除殘留液體。洗滌不當(dāng)可能會(huì)導(dǎo)致信號(hào)錯(cuò)誤升高和重現(xiàn)性差。洗板完成后，請(qǐng)立即進(jìn)行下步操作，不要讓板孔干燥。

3）檢測抗體孵育

⑦ 稀釋檢測抗體：按照說明書或預(yù)實(shí)驗(yàn)，用1×稀釋緩沖液將檢測抗體稀釋到需要的濃度。

⑧ 孵育：每孔加入100μL檢測抗體，室溫孵育1h。

⑨ 洗板：同步驟⑥

Tips：如果采用間接雙抗夾心法，還需要進(jìn)行二抗孵育，操作步驟同檢測抗體孵育。二抗除了用1×稀釋緩沖液稀釋外，也可用10mM PBST稀釋。

4）顯色反應(yīng)

⑩ 加底物顯色：每孔加入100μL顯色底物TMB（一般為顯色液A和B的等量混合物），避光，室溫孵育15-20min。

Tips：可根據(jù)實(shí)際顯色情況酌情縮短或延長顯色時(shí)間，但不可超過30min。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品孔顏色出現(xiàn)明顯梯度時(shí)，前4孔出現(xiàn)明顯的藍(lán)色梯度，后3-4孔不明顯，即可終止反應(yīng)。

5）終止反應(yīng)

? 每孔加入100μL 終止液。終止液加入順序應(yīng)與底物加入順序相同。

Tips：終止液加入后酶標(biāo)板孔內(nèi)液體的顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色。如果顏色呈現(xiàn)綠色或者顏色的變化不均勻，請(qǐng)輕輕叩擊板框，水平充分混勻。

? 提前15 min打開酶標(biāo)儀預(yù)熱。

6）吸光度讀值

? 讀數(shù)：加入終止液后10分鐘內(nèi)，在450nm波長處讀取整個(gè)板的吸光度（OD）。

? 結(jié)果判讀：

a 每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣本的OD值須減去零孔的OD值

b如設(shè)置復(fù)孔，則應(yīng)取其平均值

c以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

d 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，代入樣品OD值計(jì)算出相應(yīng)的擬合濃度，再乘以稀釋倍數(shù)即為樣本的測定濃度。

Tips：建議進(jìn)行630nm和450nm雙波長檢測。630nm的OD值為酶標(biāo)板材質(zhì)的吸收值，用450nm測定的OD值減去630nm的OD值，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性更高些。

注：以上步驟主要參考義翹神州人IL-6 ELISA試劑盒的操作步驟，不同廠家的試劑盒操作細(xì)節(jié)可能會(huì)不同，請(qǐng)?jiān)陂_始前一定要仔細(xì)閱讀產(chǎn)品說明書！

四、雙抗夾心法小結(jié)

雙抗夾心ELISA憑借“雙高"特性（高靈敏度和高特異性），廣泛用于科學(xué)研究和臨床研究中。比如在抗體藥研發(fā)領(lǐng)域，ICH Q5E指南推薦PK定量分析、雜質(zhì)分析以及結(jié)合活力等測定時(shí)使用此方法。

雙抗夾心ELISA利用捕獲抗體和檢測抗體識(shí)別抗原的不同表位，降低了非特異性信號(hào)和交叉反應(yīng)。靈敏度比直接法和間接法高2-5倍，可檢測低至皮克級(jí)的抗原，適合低濃度靶抗原檢測，常用于病毒（如HIV、流感）、生物標(biāo)志物（細(xì)胞因子、腫瘤標(biāo)志物等）檢測。

雙抗夾心ELISA也存在一些局限性。僅適用于具有多個(gè)抗原表位的大分子蛋白，小分子抗原建議使用競爭法。捕獲抗體和檢測抗體必須識(shí)別不同表位，篩選比較困難。操作中需避免鉤狀效應(yīng)（抗原過量導(dǎo)致假陰性），可通過稀釋樣本或優(yōu)化抗體濃度解決。

核心操作要點(diǎn)回顧：

實(shí)驗(yàn)開始之前將所用試劑、樣品平衡至室溫，不可在37℃加熱。酶標(biāo)儀請(qǐng)?jiān)陲@色反應(yīng)終止前15分鐘開機(jī)預(yù)熱。

樣品復(fù)融后如果有沉淀需要再次離心，取上清檢測。

所有的加液過程要注意懸空滴加，勿觸及酶標(biāo)板孔壁和孔底。

試劑或樣品配制時(shí)，需充分混勻并盡量避免起泡。

標(biāo)曲和樣品建議做復(fù)孔檢測。

從原理理解到規(guī)范操作，從細(xì)節(jié)把控到問題解決，希望這份教程能成為你ELISA實(shí)驗(yàn)的可靠指南。實(shí)驗(yàn)成功的秘訣，往往就藏在每一個(gè)被認(rèn)真對(duì)待的步驟里。

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