博格隆(浙江)生物技術(shù)有限公司
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引言
慢病毒（Lentivirus，LV）作為一種優(yōu)秀的病毒載體，被成熟運(yùn)用于細(xì)胞免疫治療中，尤其是在Car-T療法中的廣泛運(yùn)用，為腫瘤和免疫疾病的治療帶來了新的方向。
慢病毒來源于人免疫缺陷病毒，是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種。它通過將外源基因整合到宿主基因序列中，可以實(shí)現(xiàn)外源基因的穩(wěn)定表達(dá)。目前使用的慢病毒經(jīng)過科學(xué)家對膜蛋白的改造、去除復(fù)制相關(guān)基因和毒性基因等操作，獲得較高的安全性和廣泛的宿主感染能力，同時(shí)具有本身裝載容量大、可實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定外源基因表達(dá)的特點(diǎn)。
慢病毒的性質(zhì)
慢病毒的結(jié)構(gòu)和特性使其在基因治療中具有優(yōu)勢，但同時(shí)也對生產(chǎn)和純化提出了挑戰(zhàn)：
• 單鏈RNA病毒
• 細(xì)胞裂解型
• 直徑80~120nm
• 裝載容量：9kb左右
• 包膜結(jié)構(gòu)：對低pH、高溫、剪切力及鹽濃度敏感
慢病毒生產(chǎn)工藝
目前，慢病毒的生產(chǎn)通常通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK 293細(xì)胞進(jìn)行貼壁/懸浮培養(yǎng)，其工藝流程包括以下幾個(gè)步驟：HEK293細(xì)胞培養(yǎng)、澄清、核酸酶處理、超濾濃縮、層析純化、超濾換液和除菌過濾。
Fig.1 慢病毒生產(chǎn)工藝流程
慢病毒的活性需要依靠完整的包膜結(jié)構(gòu)，但其包膜上的某些糖蛋白對高溫、剪切力、鹽濃度都敏感，包膜容易受到破壞導(dǎo)致病毒失活。
因此，在生產(chǎn)過程中要注意條件控制，例如超濾環(huán)節(jié)可采用300~750KD中空纖維柱，有效降低剪切力和壓力，控制剪切力＜4000/s-1，TMP為3~7psi，濃縮5~10倍。在層析步驟，要注意減少慢病毒與高鹽條件的接觸時(shí)間，適當(dāng)添加穩(wěn)定劑。慢病毒體積較大，采用0.22μm濾器進(jìn)行除菌過濾收率一般只有60%~70%，為提高收率，生產(chǎn)過程可采用無菌生產(chǎn)工藝。對于工藝過程中慢病毒的回收率，需要重點(diǎn)考察感染滴度回收率，可采用QPCR或FACS法檢測感染滴度。
慢病毒的純化策略
在層析純化之前，慢病毒通常經(jīng)過核酸酶處理和過濾去除部分雜質(zhì)。然而，HCP（宿主細(xì)胞蛋白）、HCD（宿主細(xì)胞DNA）等殘留雜質(zhì)仍需通過層析純化進(jìn)一步去除。根據(jù)慢病毒顆粒與雜質(zhì)的大小和等電點(diǎn)差異，推薦使用復(fù)合模式和陰離子交換等填料進(jìn)行純化。
Fig.2 博格隆復(fù)合模式填料（上）與陰離子交換填料（下）產(chǎn)品
Diamond Layer 700 是一款專為病毒和大分子純化設(shè)計(jì)的復(fù)合模式填料。其雙層結(jié)構(gòu)使得大分子病毒不進(jìn)入孔隙，直接流過柱床，而大部分雜質(zhì)則通過離子和疏水相互作用被吸附在微球內(nèi)部的配基上。該填料具有操作靈活性佳、上樣量大、流速高的特點(diǎn)，與傳統(tǒng)的4FF、6FF分子篩相比，效率更高。
• 應(yīng)用案例：采用Diamond Layer 700純化慢病毒，通常上樣量為0.3~6 CV，病毒感染收率可達(dá)60%以上。在上游雜質(zhì)較少的情況下，一步純化即可滿足質(zhì)量要求。
Diamond Q Mustang 和 Diamond DEAE Mustang 是兩種高分辨率的陰離子交換填料，可以用于進(jìn)一步去除HCP、HCD、內(nèi)毒素等雜質(zhì)。雖然Q型強(qiáng)陰離子填料的載量高于DEAE弱陰離子填料，但因?yàn)镼填料配基的季氨基化，純化過程中會對慢病毒包膜結(jié)構(gòu)造成影響，其感染回收率遠(yuǎn)低于DEAE填料。因此，選擇適合的陰離子填料不僅能確保產(chǎn)品質(zhì)量，還要根據(jù)病毒的特點(diǎn)合理調(diào)整工藝條件。
值得注意的是，慢病毒對高鹽敏感，陰離子交換純化過程中常用的NaCl 500mM以上洗脫后需迅速稀釋至200mM以下，避免對病毒結(jié)構(gòu)的破壞。慢病毒在1M NaCl接觸1小時(shí)后，其感染活性會損失50%左右。同時(shí)，建議在整個(gè)純化過程中添加5%蔗糖作為穩(wěn)定劑，進(jìn)一步保護(hù)病毒的活性。
結(jié)語
慢病毒的高效純化是確?；蛑委熀图?xì)胞治療成功的關(guān)鍵。通過合理選擇層析介質(zhì)并優(yōu)化工藝參數(shù)，可以顯著提高慢病毒的回收率和純度。無論是Diamond Layer 700復(fù)合模式填料還是Diamond Q/DEAE Mustang陰離子交換填料，均提供了高效的解決方案，助力高質(zhì)量的慢病毒生產(chǎn)。
相關(guān)產(chǎn)品信息
復(fù)合模式層析填料
陰離子交換層析填料
更多產(chǎn)品請至站內(nèi)或博格隆查詢。
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