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1．包被高結(jié)合性的微孔板，一個(gè)孔用于陽(yáng)性篩選（加入酶），一個(gè)孔作為本底（不加入 酶）。如果使用的文庫(kù)很大（大于109個(gè)不同的克?。?，在*輪篩選中就要包被更多 的孔（或者更大的孔，隨后過(guò)程中溶液的體積也要相應(yīng)加大），這樣才能結(jié)合更多的噬菌體，保證克隆的多樣性。粗略估計(jì)，96孔板的一個(gè)孔能夠結(jié)合109個(gè)噬菌粒，并且在*輪篩選中zui少要能夠結(jié)合10倍于文庫(kù)中克隆數(shù)量的噬菌粒。當(dāng)隨后幾輪中文庫(kù)的多樣性隨著篩選的進(jìn)行而降低時(shí)，這樣的一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照孔應(yīng)該是足夠的。
2．棄去包被液、封板、洗滌，然后控干。
3．在每孔中加入10’’cfu溶解于PBST中的底物噬菌粒。室溫反應(yīng)2小時(shí)。然后洗板。
4．用蛋白酶反應(yīng)緩沖液洗板。在酶陽(yáng)性篩選孔中加入100/1l溶解于反應(yīng)緩沖液的蛋白酶，在本底孔中僅加入100fAl緩沖液。室溫反應(yīng)10分鐘（或優(yōu)化后的反應(yīng)時(shí)間）并溫和搖動(dòng)。
5．將蛋白酶洗脫下來(lái)的噬菌粒以及本底的噬菌粒溶液移入離心管中。
6．蛋白酶敏感的噬菌粒的擴(kuò)增：對(duì)于蛋白酶酶切處理的樣品， 留下一部分（約25ul）用于滴度測(cè)定，其余的用于擴(kuò)增噬菌體，繼續(xù)下一輪的篩選。
7．蛋白酶抗性噬菌粒的擴(kuò)增： 用PBST洗板3次，在每孔中加入100u1 0．2m01/L、pH2．0的甘氨酸溶液，反應(yīng)5分鐘并溫和搖動(dòng)。
8．將甘氨酸溶液洗脫下來(lái)的噬菌粒移入離心管，并加入10ul 1mol/L Tris堿以中和其酸性。
9．甘氨酸溶液洗脫得到的樣品也可以使用如步驟6所述的用于蛋白酶敏感性噬菌粒的方法擴(kuò)增，繼而通過(guò)另外一個(gè)單獨(dú)的篩選繼續(xù)測(cè)定其抗性。如果要進(jìn)一步測(cè)定其抗性，那么應(yīng)該在接下來(lái)的篩選過(guò)程中增加蛋白酶的濃度并且（或）增加反應(yīng)時(shí)間，從而篩選出對(duì)蛋白酶更具抗性的序列。
10．噬菌粒滴度測(cè)定：用感染F’大腸桿菌的方法，對(duì)初始的噬菌粒、蛋白酶酶切作用下洗脫的噬菌粒以及甘氨酸洗脫的噬菌粒樣品進(jìn)行滴度測(cè)定。
11．在接下來(lái)的日子里，制備富集的噬菌粒，并重復(fù)篩選過(guò)程。通常會(huì)使用本底（不加入蛋白酶）來(lái)監(jiān)控篩選過(guò)程中的富集。
12．滴度測(cè)定的結(jié)果分析：如果篩選的能力很強(qiáng)，陽(yáng)性的富集度[（蛋白酶酶切作用下洗脫的cfu）/（沒(méi)有蛋白酶酶切作用下洗脫的c{u）>1）可以在2～3輪篩選后得到。每輪中隨機(jī)挑選約20個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序來(lái)看富集是否已經(jīng)達(dá)到極限。如果找到了一些序列相同 （同源序列）的克隆，那么篩選就完成了或者可以說(shuō)是接近完成了，再繼續(xù)進(jìn)一步的篩選過(guò)程就沒(méi)有多大意義了。從另外一個(gè)不同的，但序列相關(guān)的肽文庫(kù)中而不是繼續(xù)從已篩選出一個(gè)舉克隆的文庫(kù)中繼續(xù)篩選，可能會(huì)讓我們得到更多的信息。在任何時(shí)候，如果所有已結(jié)合的噬菌粒能夠以一個(gè)很高的比例（>50％）被切割，那么應(yīng)該通過(guò)降低蛋白酶的濃度來(lái)增加選擇壓力。雖然通過(guò)測(cè)定噬菌體滴度來(lái)監(jiān)控富集度可以有效地分析底物篩選的過(guò)程，但這可能得出各種各樣的結(jié)果，也不應(yīng)該把它視為檢測(cè)序列收斂的替代方法。事實(shí)上，即使在篩選的過(guò)程中未能看到噬菌體的顯著富集，序列也能夠在篩選的過(guò)程中趨于一致。