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循環(huán)PCR是一種在編碼序列上相隔較遠(yuǎn)但不連續(xù)的一些位置上設(shè)計(jì)突變的方法。在泛素的案例中，組合在特定位點(diǎn)上的含有簡并密碼子DTS的4個(gè)重疊的引物，以得到128 bp長的產(chǎn)物。

用循環(huán)PCR來組裝雙鏈的筒并誘變寡核苷酸
[器材和試劑]
● Deep Vent DNA聚合酶 （New England Biolabs）
● 10XDeep Vent DNA聚合酶緩沖液（New England Bi01abs）
● 100mm01/LMgS04 （NewEnglandBiolabs）
● G、 A、 T、 C各含25 mmol/L的dNTP（NaW England Bi01abs）
● 無菌超純水
● PCR儀
● 礦物油（Sigma）
● 瓊脂糖凝膠電泳所需的設(shè)備及試劑
● 離心柱式試劑盒（Stratagene-Strataprep型DNA膠回收試劑盒，Cat．number 400766）
[方法]
1．根據(jù)泛素文庫引物的示例所闡明的原理，為循環(huán)PCR的方法設(shè)計(jì)引物。內(nèi)側(cè)引物之間的重疊部分應(yīng)為約20個(gè)核苷酸，并且熔解溫度在55—60℃之間。如果可能應(yīng)設(shè)計(jì)互補(bǔ)部分避開誘變位置。
2．準(zhǔn)備lml的引物儲(chǔ)存液，用無菌去離子水配成的10pmol/ul濃度。
3．準(zhǔn)備lml體積的“內(nèi)側(cè)”引物的梯度稀釋液，濃度依次為：lpmol/ul、0．1pmol/ul、0．01pmol/ul。利用這些引物稀釋液，建立一系列具有不同的外側(cè)引物和內(nèi)側(cè)引物之比的PCR反應(yīng)（如：1：1、1：0．1、1： 0．01或l：0．001）。
4．依次加入下列試劑并混勻，建立一系列PCR反應(yīng)體系：
● 超純水，67/Al
● 10XDeepVentDiNA聚合酶緩沖液，10ul
● 100mmol/L MgSO4，6ul
● dNTP，5u1
● 引物1（10pm01/ul），2．5ul
● 引物2（合適的稀釋液），2．5ul
● 引物3（合適的稀釋液）2．5ul
● 引物4（10pmol/ul），2．5ul
● DeepVentDiNA聚合酶（2u/ul），2．0ul
5．將小管短暫離心，用礦物油①覆蓋液面后將小管置于PCR儀中。
6．讓反應(yīng)進(jìn)行25～30個(gè)循環(huán)，條件為：94℃2分鐘；在引物重疊部分的熔解溫度下2分鐘（在泛素案例中是56℃）；72℃1分鐘；zui后再在72℃下保持10分鐘。
7．用合適比例（如對(duì)于這里128 bp的目標(biāo)產(chǎn)物用1％一2％的比例）的低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠純化PCR產(chǎn)物，切下恰當(dāng)大小的條帶，用離心柱式試劑盒或者其他的標(biāo)準(zhǔn)步驟提取DNA，并連接反應(yīng)成功的反應(yīng)產(chǎn)物。