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[器材和試劑]
● 硝酸纖維膜（Protran，0．45ptm孔徑，Schleicher&Schuell）
● Stratalinker UV crosslinker（Stratagene）
● 抗-pⅢmAb 57D1溶液（2ug/ml，50mmol/LNaHC03，pH 9．6）
● 封閉液（含5％脫脂牛奶，0．05％ Tween-20 PBS）
● PBST（PBS，0．05％Tween-20）
● LB-瓊脂培養(yǎng)基+Amp/Kan+IPTG[LB-瓊脂培養(yǎng)基 +50ug/ml Amp，20ug/ml Kan，35ug/ml IPTG]
● LB-瓊脂培養(yǎng)基+Amp/Glu[LB-瓊脂培養(yǎng)基，50ug/ml Amp，l％葡萄糖]
● IPTG
● LB
● LB+Amp（LB，50ug/ml Amp）
● PBS
● TB
● M13K07輔助噬菌體（Amersham Biosciences）
● DHF’大腸桿菌細(xì)胞
● ELISA多孔板（1mmuno plate Maxisorp，NUnC）
● 96-針網(wǎng)格裝置（‘Q’rep，Genetix）
● f1R1
● 抗人（Fc特異性）堿性磷酸酶標(biāo)記抗體（Sigma；用封閉液1：5000稀釋）
● 顯色緩沖液（100mmol/LNaCl，5mmol/L MgCl2，100mmol/LThs-HCl，pH 9．6）
● 顯色溶液（330mg/m1四唑硝基藍(lán)，165mg/m1 5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸溶于顯色緩沖液中）

[方法]
A.膜A的制備
1．在Stratalinker UV crosslinker中，將直徑150mm的硝酸纖維膜用UV-曝光滅菌，每 面4分鐘；在4℃下，用10m1抗-pⅢmAb 57D1，/溶液孵育過(guò)夜。
2．在室溫下，用新鮮制備的封閉液孵育膜2小時(shí)。除去封閉液， 用無(wú)菌PBST洗滌膜，貼在一個(gè)直徑150mm的LB-瓊脂培養(yǎng)基+Amp/Kan+IPTG平板表面上。
B，膜B的制備（用于單張濾膜的篩選）
1．用噬菌體文庫(kù)感染DH5。F，細(xì)菌細(xì)胞，37℃孵育2分鐘。
2．而后，用moi值為20～50的輔助噬菌體M13K07超感染同樣細(xì)胞，37℃孵育2分鐘。
3．離心去除未吸收的輔助噬菌體，小心將感染細(xì)胞鋪在一張硝酸纖維膜上。該膜已預(yù)先覆蓋在膜A上，而膜A也已放在LB-瓊脂培養(yǎng)基板表面。用一個(gè)無(wú)菌玻璃涂布器去掉濾膜與平板間的氣泡，并促進(jìn)細(xì)菌懸液的吸收?；蛘哂檬删w文庫(kù)感染DH5。F’細(xì)菌細(xì)胞，再鋪在LB-瓊脂培養(yǎng)基+Amp/G1u平板上。37℃孵育過(guò)夜，刮取細(xì)菌菌落，懸浮在含有100ug/m1Amp的L-液體培養(yǎng)基中，然后在37℃下培養(yǎng)到As。。鋁0．2。用moi值為20～50的輔助噬菌體M13K07感染細(xì)胞。37℃孵育15分鐘， 離心去未吸收的輔助噬菌體，如上所述方法，小心將感染細(xì)胞鋪在UV-滅菌的硝化纖維膜A上。
C．膜B的制備（用于多重濾膜的篩選）
1．采用上述實(shí)驗(yàn)方案，在含100ug/ml Amp、20ug/m1 Kan、1％G1u的LB-瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)AmpR、KanR細(xì)菌克隆，37℃孵育過(guò)夜。用單個(gè)克隆在UV-滅菌的ELISA多孔板中的孔內(nèi)孵育，孔內(nèi)有200ul含100mg/ml Amp、20ug/ml Kan和1％葡萄糖的L-液體培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)過(guò)夜，用無(wú)菌96-針網(wǎng)格裝置（‘Q’rep，Genetix）將菌落從這個(gè)主板中一步轉(zhuǎn)移到膜B上（膜B放于膜A和LB-瓊脂培養(yǎng)基平板之上）。這步操作可在不同膜上重復(fù)數(shù)次。方形平板可有效利用LB-瓊脂培養(yǎng)基平板的空間。
2．用含有1×1010pfu/m1 f1R1噬菌體和5/11/ml感染細(xì)菌細(xì)胞蛋白提取物的封閉液，按1：100比例稀釋原始血清。室溫下孵育30分鐘。在這一步，可加入預(yù)期濃度的競(jìng)爭(zhēng)性抗原。
3。37℃培養(yǎng)過(guò)夜，標(biāo)記兩膜的相對(duì)位置。去掉膜A。大部分膜上的菌落仍保持活性，可再培養(yǎng)進(jìn)行傳代或抽提質(zhì)粒。將膜B轉(zhuǎn)移到一個(gè)培養(yǎng)皿中，用預(yù)先孵育的血清混合物在室溫下孵育2小時(shí)。
4。用PBST*洗滌膜B，用抗人（Fc特異性）堿性-磷酸酶標(biāo)記抗體在室溫下孵育1小時(shí)。
5．如上*洗滌膜，再用顯色緩沖液洗滌，用顯色溶液在室溫下孵育2～15分鐘。用20mmol/LEDTA洗滌濾膜，終止反應(yīng)。