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產(chǎn)品編號： EIA06720
使用前*閱讀說明書。本酶聯(lián)免疫試劑盒是基于經(jīng)典酶聯(lián)夾心技術(shù)原理，能測量大鼠TFR，只能用于研究用途，不得用于醫(yī)學診斷。

工作原理
TFR轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體是一種以非二硫鍵連接的跨膜糖蛋白，該蛋白由二個*相同的肽鏈組成，每條肽鏈的分子量為95KD。TfR-轉(zhuǎn)鐵蛋白-鐵復合物通過細胞內(nèi)吞泡的內(nèi)在化途徑由細胞膜進入細胞液。鐵留在細胞液中，TfR-轉(zhuǎn)鐵蛋白復合物通過再循環(huán)返回到細胞表面。所提供的ELISA Kit是典型的夾心法酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（ELISA）。預先包被的抗體為多克隆抗體。檢測相抗體也為多克隆抗體，經(jīng)生物素（biotin）標記。樣品和生物素標記抗體先后加入酶標板孔反應后，PBS或TBS洗滌。隨后加入過氧化物酶標記的親和素反應；經(jīng)過PBS或TBS的*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的待測因子呈正相關(guān)。

每套試劑盒中內(nèi)容（96T）
材料 數(shù)量
標準品 96T（2vial）
預包被抗體的96孔板 96T（8×12）
生物素標記抗體 96T （1:100）
ABC（親和素-過氧化物酶復合物） 96T （1:100）
樣品稀釋液 96T×2
抗體稀釋液 96T×1
ABC稀釋液 96T×1
TMB顯色液A 96T×1
TMB顯色液B 96T×1
TMB終止液 96T×1
ELISA洗滌液 96T×1（1:25）

需要而未提供的試劑和器材
1． 37℃恒溫箱。
2． 標準規(guī)格酶標儀。
3． 自動洗板機。
4． 單通道或多通道可調(diào)節(jié)移液器以及其吸頭。
5． 蒸餾水，容量瓶等
6． 干凈的試管和Eppendof管。

注意事項
1． 從-20℃取出的試劑盒，在4℃解凍過夜。盒內(nèi)每一瓶解凍的溶液在開啟瓶蓋之前都要輕輕搖勻，避免解凍時出現(xiàn)的分層，否則會出現(xiàn)濃度不均一的現(xiàn)象。
2． 開啟試劑盒之前要室溫平衡至少30分鐘。
3． 配制各種試劑時，切記混勻！
4． 用戶在初次使用試劑盒時，應將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底。
5． 建議所有標準品、樣本都做雙份檢測。
6． 要嚴格避免操作過程中酶標板干燥。干燥會使酶標板上生物成份迅速失活！
7． 為免交叉污染，要避免重復使用手中的吸頭和試管。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的PBS或TBS洗滌緩沖液至少0.35ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要，重復此過程數(shù)次。
自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

樣品的準備和保存
樣品如果不立即分析，應分裝后冷凍保存，且避免反復凍融。
血清——用干凈試管收集血液，室溫凝固2小時或4℃過夜，離心1000×g 10分鐘，收集血清。立即分析或分裝后-20℃冷凍保存。
細胞培養(yǎng)、組織勻漿、體液——離心去除沉淀，立即分析或分裝后-20℃冷凍保存。

樣品稀釋的一般原則
用戶須查閱文獻了解標本內(nèi)待測因子的含量，決定適當?shù)南♂尡稊?shù)，以使稀釋后樣品中待測因子的濃度處于ELISA試劑盒的*檢測范圍。樣品的稀釋應有詳細記錄。

試劑的準備和保存
A. 標準品的稀釋和使用：在使用前2小時內(nèi)準備。將凍干品管內(nèi)加入1ml樣品稀釋液，*溶解后做倍比稀釋。
稀釋后的標準品在2小時內(nèi)使用。

B．生物素標記抗體工作液：在使用前2小時內(nèi)準備。
1． 根據(jù)每孔需要0.1ml計算總的用量（實際配制時應多配制0.1-0.2ml）。
2． 按10ul生物素標記抗體加抗體稀釋液990ul的比例配制工作液。輕輕混勻。

C．親和素-過氧化物酶復合物（ABC）工作液的準備：在使用前1小時內(nèi)準備。
1． 根據(jù)每孔需要0.1ml計算總的用量（實配時應多配制0.1-0.2ml）。
2． 按10ul親和素-過氧化物酶復合物（ABC）加ABC稀釋液990ul的比例配制工作液。輕輕混勻。

D. TMB顯色工作液的準備：在使用之前30分鐘，按TMB顯色液A 9份加 TMB顯色液B 1份的比例配制TMB顯色工作液。

操作程序
1． 確定本次檢測所需的已包被抗體的酶標板孔數(shù)目。
2． 將倍比稀釋的標準品各0.1ml依次加入一排7孔中，1孔只加樣品稀釋液的作為對照。處理后的標本按100ul每孔加入。
3． 酶標板加上蓋，37℃反應90分鐘。
4． 反應后用自動洗板機吸去酶標板內(nèi)的液體；或甩去酶標板內(nèi)液體，再對著吸水紙拍幾下。洗滌2次。
5． 將準備好的生物素抗體工作液按每孔0.1ml依次加入。37℃反應60分鐘。
6． 0.01M TBS或0.01M PBS洗滌3次，每次浸泡1分鐘左右。
7． 將準備好的ABC工作液按每孔0.1ml依次加入。37℃反應30分鐘。
8． 0.01M TBS或0.01M PBS洗滌5次，每次浸泡1-2分鐘左右。
9． 按每孔0.1ml依次加入TMB顯色工作液，37℃避光反應，反應過程中，要經(jīng)常的觀察，當肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔差別不明顯時，即可加入TMB終止液0.1ml/孔。（顯色反應zui長不要超過30分鐘）。
10． 用酶標儀在450nm測定O.D.值。
11． 根據(jù)樣品的吸光值在坐標上找出對應的濃度。用戶也可以使用各種應用軟件來計算。應記住由于樣品稀釋了N倍，其實際濃度應該×N。

操作程序總結(jié)：
準備試劑，樣品和標準品

加入準備好的樣品和標準品，37℃反應90分鐘

洗板2次，加入生物素化抗體工作液，37℃反應60分鐘

洗板3次，加入ABC工作液，37℃反應30分鐘

洗板5次，加入TMB顯色液，37℃反應

加入TMB終止液

30分鐘之內(nèi)讀OD值

計算標本待測因子含量

檢測范圍：100 nmol/ml→1.5nmol/ml。
敏感性： ＜0.5 nmol/ml
特異性： 系統(tǒng)和其它因子無交叉反應。
保存： -20℃ [短期內(nèi)（如兩周）可4℃]
有效期： 12個月（-20℃）。
用途： 用于體外定量分析液體標本（通用型）。

REFERENCES
1. Nature 388:394-397（1997）.
2. Nat. Genet. 25:187-191（2000）.
3. Protein Sci. 13:2819-2824（2004）.
4. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:588-593（1998）.
5. Nature 408:111-115（2000）.
6. J. Biol. Chem. 277:1845-1854（2002）.
7. J. Immunol. 173:3589-3593（2004）.
8. Cell 130:906-917（2007）.
9. Genetics 158:1657-1664（2001）.
10. Hum. Mol. Genet. 14:1449-1455（2005）..