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原理

利用螢光染劑（bisbenzimide, Hoechst 33258）偵測支原體污染。此染劑會結(jié)合到DNA之Adenosine-Thymidine (A-T) rich區(qū)域，因為支原體之DNA中A-T含量占多數(shù)（55～80%），所以可將其染色而偵測。被支原體污染之細胞經(jīng)染色后，在細胞核外與細胞周圍可看到許多大小均一之螢光小點，即為支原體之DNA，證明有支原體之污染。 

測試步驟用間接步驟，將待測細胞懸浮液或細胞培養(yǎng)液接種于指示細胞培養(yǎng)液中（indicator cell，例如Vero cell or 3T6 cell），然后培養(yǎng)指示細胞再作螢光染色。正負反應(yīng)對照組亦可以接種于indicator cell內(nèi)作為對照。 

待測細胞亦可作直接測試，但需為吸附型細胞，培養(yǎng)后直接作螢光染色。有些細胞易有螢光背景，而干擾結(jié)果判讀，則建議使用接種于指示細胞之步驟。 

特點

簡單、經(jīng)濟與靈敏，廣泛使用，可作為例行之偵測步驟?？梢詡蓽y不易培養(yǎng)之支原體，例如M. hyorhinis，較直接培養(yǎng)法快，約一星期即可知道結(jié)果。 

 缺點：有時仍會有螢光背景，影響判讀。 

材料

Hanks’ balanced salt solution without NaHCO3 or phenol red (HBSS, GibcoBRL 21250-014﹚、bisbenzimide (Hoechst No.33258, Sigma B-2883)、thimerosol (Sigma T-5125)、0.1M citric acid、02M disodium phosphate、glycerol、glacial acetic acid、methanol、strerile H2O、chamber slide (Nunc 177380)或chamber slide替代物：35 or 60mm sterile plate內(nèi)放置無菌22x22mm蓋玻片﹙浸于酒精內(nèi)，使用前過火滅菌﹚，一般吸附型細胞均能吸附在蓋玻片上。染色后取出蓋玻片，細胞面朝下放在玻片上觀察。 

Indicator cells: Vero (African green monkey kidney, ATCC CCL-81 or CCRC 60013) or 3T6(mouse fibroblast, ATCC CCL-96 or CCRC 60070)，細胞須先測試無污染。αMEM with 10%FBS ( medium for Vero cell) 

配制試劑: 

無菌HBSS：配制Hanks’ balanced salt solution，以0.22mm無菌過濾膜過濾滅菌。勿用高壓蒸汽滅菌。 

Hoechst 33258 stock solution（100X）︰稱取5.0 mg bisbenzimide和10.0 mg thimersol溶于100 ml無菌HBSS，置于棕色瓶中，室溫下以電磁攪拌器攪拌30分鐘至*溶解后，以1ml分裝至1.5ml小離心管中，貯存于-20℃。 

Hoechst 33258 working reagent︰取1 ml Hoechst 33258 stock solution，加入sterile 100 ml HBSS中，室溫下攪拌45分鐘，置于棕色瓶中并以鋁箔紙包覆，避免光照，貯存于4℃。 

mounting solution：22.2 ml 0.1 M citric acid和27.8 ml 0.2 M Na2HPO4加入于50 ml glycerol中混合，以1 N NaOH調(diào)整pH至5.5（pH很重要），貯存于4℃。 

固定溶液（fixative）：冰醋酸與甲醇以1︰3之體積比例混合，使用前才配制。 

步驟： 

培養(yǎng)Vero細胞： Vero細胞可作長期培養(yǎng)或制作多個冷凍保存管，測試前解凍培養(yǎng)。測試前一周培養(yǎng)Vero細胞。 

在接種測試樣品前一日，以trypsin-EDTA溶液處理Vero細胞，制成細胞懸浮液，以1~2x10^4 cells／ml培養(yǎng)于chamber slide中，每個well加入1ml細胞懸浮液，于37℃, 5％CO2培養(yǎng)。隔日確定生長良好后，即可接種測試樣品。 

接種測試樣品：樣品種類：1ml待測之培養(yǎng)基，1ml待測細胞培養(yǎng)液（可將細胞稍微刮下﹚，0.05~0.1ml冷凍管之細胞懸浮液。 

將測試樣品加入chamber slide內(nèi)，培養(yǎng)5天后，進行Hoechst 33258的螢光染色觀察。 

以Acholeplasma laidlawii ATCC 23206 感染Vero細胞作為正反應(yīng)對照組﹙或是已感染支原體之細胞培養(yǎng)液或冷凍細胞液﹚，負反應(yīng)對照組為Vero cell之新鮮培養(yǎng)基( αMEM +10%FBS)。 

DNA螢光染色檢測：

取出培養(yǎng)5日之Vero細胞，吸除培養(yǎng)液。于每個well中加入2 ml 1:3混合的冰醋酸/甲醇固定液，靜置10 min后，吸除固定液。重復(fù)上述之步驟，風干10分鐘。 

于每個well中，加入1 ml Hoechst 33258 working solution，室溫下靜置30 min。 

吸掉Hoechst 33258染液后，以無菌水洗滌3次，風干后加入1滴的mounting solution，并以蓋玻片覆蓋之。 

以100x-400x螢光顯微鏡觀察。打開水銀光源10 min后，以UV激發(fā)光束(330～380 nm)之濾光鏡，觀察細胞核外是否有藍色螢光小點或是絲狀點之螢光物產(chǎn)生。 

結(jié)果判讀

若有支原體污染，在Vero細胞核外與細胞表面會出現(xiàn)藍色螢光小點或是絲狀點。其形狀一致，與細胞殘片染成之不規(guī)則點狀物不同。其螢光可維持數(shù)星期。

圖例 (A)為negative result : 螢光顯微鏡下，只觀察到Vero細胞的細胞核，測試樣品沒有支原體的污染。(為positive result : 在Vero細胞核外與細胞表面會出現(xiàn)藍色螢光小點和絲狀點，表示測試樣品有支原體的污染。