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免疫共沉淀技術(shù)服務(wù)

1、 免疫共沉淀服務(wù)流程

① 收集培養(yǎng)的細(xì)胞(1×107～1×108);

② 用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞

③ 冷凍離心機(jī)離心，取上清;

④ 加入相應(yīng)抗體，溫育過(guò)夜;

⑤ 預(yù)處理protein A瓊脂糖珠;

⑥ 將預(yù)處理過(guò)的protein A瓊脂糖珠加入到上述液體，溫育;

⑦ 低速離心，將瓊脂糖珠離心至管底;

⑧ SDS-PAGE、Western印跡或質(zhì)譜儀分析。

注：以上流程是以Protein A瓊脂糖珠法為例，根據(jù)免疫共沉淀方法不同，操作步驟有所區(qū)別。

圖1 免疫共沉淀流程

2、 免疫共沉淀原理

免疫共沉淀(Co- Immunoprecipitation, Co-IP)是利用抗原和抗體的特異性結(jié)合以及細(xì)菌的Protein A或G特異性地結(jié)合到免疫球蛋白的Fc片段的現(xiàn)象開(kāi)發(fā)出來(lái)的方法。Co-IP是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法，是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。免疫共沉淀技術(shù)基本原理是細(xì)胞裂解液中加入抗體，與抗原形成特異免疫復(fù)合物，經(jīng)過(guò)洗脫，收集免疫復(fù)合物，然后進(jìn)行SDS-PAGE及Western印跡分析。當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)問(wèn)的相互作用被保留了下來(lái)。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來(lái)。這種方法常用于測(cè)定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合，也可用于確定某一特定蛋白質(zhì)新的作用輔助方法(圖2)。

圖2免疫共沉淀原理

3、 免疫熒光分類

① Protein A瓊脂糖珠法;

② Protein G-Sepharose法;

③ 已知抗體蛋白耦聯(lián)磁珠法;

4、 免疫共沉淀優(yōu)缺點(diǎn)：

① 免疫共沉淀優(yōu)點(diǎn)：

a: 蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的，可以避免人為的影響;

b: 可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物;

c: 相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài);

② 免疫共沉淀缺點(diǎn)：

a: 兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用;

b: 可能檢測(cè)不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用;

c: 實(shí)驗(yàn)具有不確定性：實(shí)驗(yàn)前預(yù)測(cè)目的蛋白以選擇檢測(cè)的抗體，若預(yù)測(cè)不正確，實(shí)驗(yàn)就得不到結(jié)果。

5、 免疫共沉淀所需材料

(以Protein A瓊脂糖珠法為例)

① 免疫共沉淀試劑：

a: SDS-PAGE制膠緩沖液;

b: SDS-PAGE電泳緩沖液;

c: Loading Buffer;

d:考馬斯亮藍(lán)或硝酸銀;

e:考馬斯亮藍(lán)脫色液或銀染脫色液;

f: PBS緩沖液;

② 免疫共沉淀耗材：

a: 待檢樣本(培養(yǎng)細(xì)胞);

b:細(xì)胞裂解液;

c: Protein A瓊脂糖珠;

d:丙烯酰胺;

e: N,N,-甲叉雙丙烯酰胺;

③ 儀器：

a: 質(zhì)譜分析儀;

b: 蛋白質(zhì)電泳槽裝置;

c: 蛋白質(zhì)電泳儀;

d: 臺(tái)式冷凍離心機(jī);

圖3蛋白質(zhì)電泳槽圖 圖4臺(tái)式冷凍離心機(jī)

6、 材料要求

① 避免細(xì)胞污染;

② 收集細(xì)胞時(shí)，不能破壞細(xì)胞內(nèi)存在的所有蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用;

③ 實(shí)驗(yàn)材料涉及危險(xiǎn)品，loogene公司不予服務(wù);

④ 待檢細(xì)胞盡量新鮮，待測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好;

⑤ 提供盡量詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)背景材料;

⑥ 使用明確的抗體，可以將幾種抗體共同使用。

7、 實(shí)驗(yàn)周期

① 1-10個(gè)樣本，10個(gè)工作日

② 10-100個(gè)樣本，20個(gè)工作日

③ 100個(gè)樣本以上，40個(gè)工作日

8、 提供結(jié)果

完整的實(shí)驗(yàn)操作步驟、SDS-PAGE、Western印跡(圖5)或質(zhì)譜分析結(jié)果。

圖5 Western印跡