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吖啶橙《acridine oran。AO)屬于三環(huán)雜芳香類異嗜性陽離子熒光染料，主要以兩種方式與核酸結(jié)合，一是嵌入核酸雙鏈的堿基對之間；二是與單鏈核酸的磷酸發(fā)生靜電相互作用。當(dāng)吖啶橙與DNA或RNA結(jié)合時，zui大發(fā)射波長分別為525nm或650nm，產(chǎn)生綠色熒光或橙紅色熒光，因此，吖啶橙是研究核酸的一種常用熒光組織化學(xué) 染料。下面介紹應(yīng)用吖啶橙區(qū)分活細(xì)胞和原位組織細(xì)胞DNA和RNA熒光組織化學(xué)染色法。

 

    1．溶液配制

    (1)吖啶橙濃縮液(4℃、避光，可保存數(shù)月)

    雙蒸水    50ml

    吖啶橙    50mg

 

    (2)甲液

    雙蒸水        200ml

    HCl           16ml

    NaCl          1．74g

    Triton X-100    0．2ml

 

    (3)乙液

    0．2mol／LNa2HP04／0．1mol／L枸櫞酸緩沖液(pH 6．0)

    雙蒸水                100ml

    Na2 HP04?12H20      4．51g

    枸櫞酸(無水檸檬酸)     0．71g

    溶解后，依次加入以下試劑和吖啶橙濃縮液

    NaCl(0．15mol／L)     0．87g

    EDTA-Na(1mmol／1)    0．037g

    吖啶橙濃縮液          0．6ml

    加入吖啶橙濃縮液后，應(yīng)盡早使用。

 

    2．操作程序

    (1)取0．2ml含10％小牛血清的細(xì)胞懸液，再與0．4ml冷“甲液”混合，振蕩15秒；

    (2)加入l.2ml"乙液”，充分混勻；

    (3)于10分鐘內(nèi)，熒光顯微鏡觀察，激發(fā)波長為488nm。

    結(jié)果：DNA為黃綠色熒光，而RNA為橘紅色熒光。如果同時進(jìn)行DNA和RNA染色時，需用鰲合劑處理，使雙鏈RNA變性，確保所有的RNA均為單鏈，而雙鏈DNA不受影響，增加結(jié)果的可信性。鰲合劑以乙二胺四乙酸(EDTA)為佳。