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技術(shù)文章

醋酸纖維素薄膜電泳操作要點(diǎn)及常見差錯(cuò)和失敗原因分析

發(fā)布時(shí)間:2013-11-30
醋酸纖維素是提纖維素的羥基乙?;纬傻睦w維素醋酸酯。由該物質(zhì)制成的薄膜稱為醋酸纖維素薄膜。 種薄膜對(duì)蛋白質(zhì)樣品吸附性小,幾乎能*消除紙電泳中出現(xiàn)的“拖尾”現(xiàn)象,又因?yàn)槟さ挠H水性比較小,它所容納的緩沖液也少,電泳時(shí)電流的大部分由樣品傳導(dǎo),所以分離速度快,電泳時(shí)間短,樣品用量少,5 μg 的蛋白質(zhì)可得到滿意的分離效果。因此特別適合于病理情況下微量異常蛋白的檢測(cè)。

醋酸纖維素薄膜與濾紙相比較,有以下優(yōu)點(diǎn):
(1)分離效果好。對(duì)蛋白質(zhì)樣品吸附極少,無“拖尾”現(xiàn)象,染色后背景能*脫色,各種蛋白質(zhì)染色帶分離清晰,因而提高了定量測(cè)定的性。
(2)快速省時(shí)。由于親水性較濾紙小,電滲作用小,電泳時(shí)大部分電流是由樣品傳導(dǎo)的,所以分離速度快,電泳時(shí)間短,一般電泳45~60分鐘即可,加上染色、脫色,整個(gè)電泳完成僅需90分鐘左右。
(3)靈敏度高,樣品用量少,血清蛋白電泳僅需2 μl 血清,故常用于檢測(cè)在病理情況下微量異常蛋白質(zhì)的改變。
(4)應(yīng)用面廣。某些蛋白質(zhì)在紙上電泳不易分離,如胎兒甲種球蛋白、溶菌酶、胰島素、組蛋白等用醋酸纖維素薄膜電泳能較好地分離。
(5)易保存,易定量。醋酸纖維素薄膜電泳染色后,經(jīng)冰乙酸、乙醇混合液或其他溶液浸泡后可制成透明的干板,有利于掃描定量及長(zhǎng)期保存。

醋酸纖維素膜經(jīng)過冰醋酸乙醇溶液或其它透明液處理后可使膜透明化有利于對(duì)電泳圖譜的光吸收掃描測(cè)定和膜的長(zhǎng)期保存。
1.  材料與試劑醋酸纖維素膜一般使用市售商品,常用的電泳緩沖液為pH8.6的巴比妥緩沖液,濃度在0.05~0.09 mol/L。
2.  操作要點(diǎn)
(1)膜的預(yù)處理:必須于電泳前將膜片浸泡于緩沖液,浸透后,取出膜片并用濾紙吸去多余的緩沖液,不可吸得過干。并在一角做上記號(hào)。
(2)加樣:樣品用量依樣品濃度、本身性質(zhì)、染色方法及檢測(cè)方法等因素決定。對(duì)血清蛋白質(zhì)的常規(guī)電泳分析,每cm加樣線不超過1 μl,相當(dāng)于60~80 μg的蛋白質(zhì)。
(3)電泳:可在室溫下進(jìn)行。電壓為25 V/cm,電流為0.4~0.6 mA/cm寬。
(4)染色:一般蛋白質(zhì)染色常使用氨基黑和麗春紅,糖蛋白用甲苯胺藍(lán)或過碘酸-Schiff試劑,脂蛋白則用蘇丹黑或品紅亞硫酸染色。
(5)脫色與透明:對(duì)水溶性染料zui普遍應(yīng)用的脫色劑是5%醋酸水溶液。為了長(zhǎng)期保存或進(jìn)行光吸收掃描測(cè)定,可浸入冰醋酸:無水乙醇=30:70(V/V)的透明液中。

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