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SPRi技術(shù)檢測生物分子相互作用時，對小分子檢測有較大需求（分子量<1000 Da）。本文展示的技術(shù)可以檢測的分子量低至244 Da。
 

本實驗選擇的模型為鏈酶親和素與生物素的相互作用。鏈酶親和素結(jié)合到吡咯分子上經(jīng)電共聚合到生物芯片的金表面。然后，生物素通過與鏈酶親和素間的強親和力被捕捉到生物芯片上。
 

1.  生物芯片功能化

吡咯-鏈酶親和素和吡咯-小鼠IgG的制備與固定

室溫下，鏈酶親和素與吡咯-NHS在磷酸鹽緩沖液中結(jié)合2 h。反應(yīng)后，在含50 mM PO₄、50 mM NaCl和10%甘氨酸的磷酸緩沖液中使吡咯-鏈酶親和素結(jié)合物脫鹽。
 

小鼠IgG與吡咯-NHS的結(jié)合與上述方法相同，并用作陰性對照。
 

點樣溶液（含10%甘油的磷酸鹽緩沖液）包含20 mM的自由吡咯和濃度為12 mM、8 mM和4 mM的鏈酶親和素或小鼠IgG抗體。這些生物分子通過電化學過程固定在生物芯片表面。電聚合過程中，工作電極（棱鏡金表面）和對電極（點樣針）間生成電脈沖（2 V，100 ms）。每次點樣后，針尖用蒸餾水沖洗。點樣后的生物芯片表面見圖1。
 

圖1： 點樣后生物芯片表面
 

2.  SPRi 實驗

生物芯片功能化后，放入SPRi分析儀，流動相為10 mM PBS。

3.  注射溶液

用與流動相（10 mM PBS）相同的緩沖溶液將生物素稀釋為20 ng/mL后注入流動池中，即可在無標記狀態(tài)下實時監(jiān)測這些點陣上的相互作用。
 

1.  固定在生物芯片上小分子的SPRi定量

圖2表示20 ng/mL生物素進樣過程中，鏈酶親和素陣列點上的動力學曲線。從圖中可以看出，無論鏈酶親和素的濃度如何，它與進樣的生物素間的特異性反應(yīng)都可被觀測到。而無論小鼠IgG的濃度如何都沒有顯著的反應(yīng)。
 

8 mM鏈酶親和素比其他濃度（4 mM和12 mM）的鏈酶親和素檢測更加靈敏，而同濃度的小鼠IgG僅能檢測到背景。
 

圖2 生物素進樣后鏈酶親和素斑點和小鼠IgG斑點的動力學曲線
 

2.  蛋白質(zhì)的量與進樣次數(shù)的對比

圖3所示的柱狀圖代表結(jié)合到鏈酶親和素和小鼠IgG陣列點上的生物素量。

鏈酶親和素陣列點上生物素的量從25 pg/mm2到32pg/mm2變化，即每點在19.5 pg和25 pg之間（陣列點直徑=500 mm）。鏈酶親和素的*點樣濃度為8 mM。
 

圖3 生物素（0.02 mg/mL）進樣后鏈酶親和素和小鼠IgG 陣列點上生物素的量

Horiba Scientific開發(fā)的SPRi技術(shù)*適合小分子的檢測，如分子量低于500 Da的生物素。生物素被吡咯-鏈酶親和素陣列點特異性的捕捉顯示了我們SPRi儀器的高靈敏度。