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其原理是：當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來。目前多用精制的proreinA預(yù)先結(jié)合固化在argarose的beads上，使之與含有抗原的溶液及抗體反應(yīng)后，beads上的proreinA就能吸附抗原達(dá)到精制的目的。這種方法常用于測定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合；也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。
實驗材料 蛋白質(zhì)
試劑、試劑盒 RIPA Buffer PBS Protein A agarose 瓊脂糖 考馬斯亮藍(lán)染色液
儀器、耗材 離心機 搖床 EP管 細(xì)胞刮子 離心管 培養(yǎng)板 電泳儀 電泳槽 液相色譜儀
實驗步驟 一、試劑準(zhǔn)備
 

1. 預(yù)冷PBS，RIPA Buffer，細(xì)胞刮子（用保鮮膜包好后，埋冰下），離心機。
 

2. 用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，zui后一次吸干PBS。

3. 加入預(yù)冷的RIPA Buffer（1 ml/107個細(xì)胞、10 cm培養(yǎng)皿或150 cm2培養(yǎng)瓶，0.5 ml/5×106個細(xì)胞、6 cm培養(yǎng)皿、75 cm2培養(yǎng)瓶）。
 

4. 用預(yù)冷的細(xì)胞刮子將細(xì)胞從培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶上刮下，把懸液轉(zhuǎn)到1.5EP管中，4℃，緩慢晃動15 min（EP管插冰上，置水平搖床上）。
 

5. 4℃，14000 g離心15 min，立即將上清轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中。
 

6. 準(zhǔn)備Protein A agarose，用PBS 洗兩遍珠子，然后用PBS配制成50%濃度，建議減掉槍尖部分，避免在涉及瓊脂糖珠的操作中破壞瓊脂糖珠。
 

7. 每1 ml總蛋白中加入100 μl Protein A瓊脂糖珠（50%），4℃搖晃10 min（EP管插冰上，置水平搖床上），以去除非特異性雜蛋白，降低背景。
 

8. 4℃，14000 g離心1 5min，將上清轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中，去除Protein A珠子。
 

9． （Bradford 法）做蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定蛋白濃度，測前將總蛋白至少稀釋1：10倍以上，以減少細(xì)胞裂解液中去垢劑的影響（定量，分裝后，可以在-20℃保存一個月）。
 

10. 用PBS將總蛋白稀釋到約1 μg/μl，以降低裂解液中去垢劑的濃度，如果興趣蛋白在細(xì)胞中含量較低，則總蛋白濃度應(yīng)該稍高（如10 μg/μl）。
 

11. 加入一定體積的兔抗到500 μl總蛋白中，抗體的稀釋比例因興趣蛋白在不同細(xì)胞系中的多少而異。
 

12. 4℃緩慢搖動抗原抗體混合物過夜或室溫2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建議用2 h室溫孵育。
 

13. 加入100 μl Protein A瓊脂糖珠來捕捉抗原抗體復(fù)合物，4℃緩慢搖動抗原抗體混合物過夜或室溫1 h，如果所用抗體為鼠抗或雞抗，建議加2 μl"過渡抗體"（兔抗鼠IgG，兔抗雞IgG）。
 

14. 14000 rpm瞬時離心5 s，收集瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物，去上清，用預(yù)冷的RIPA buffer洗3遍，800 μl/遍，RIPA buffer有時候會破壞瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物內(nèi)部的結(jié)合，可以使用PBS。
 

15. 用60 μl 2×上樣緩沖液將瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物懸起，輕輕混勻，緩沖液的量依據(jù)上樣多少的需要而定（60 μl足夠上三道）。
 

16. 將上樣樣品煮5 min，以游離抗原，抗體，珠子，離心，將上清電泳，收集剩余瓊脂糖珠，上清也可以暫時凍-20℃，留待以后電泳，電泳前應(yīng)再次煮5 min變性。

二、免疫共沉淀反應(yīng)
 

1． 轉(zhuǎn)染后24-48 h 可收獲細(xì)胞，加入適量細(xì)胞裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30 min,細(xì)胞裂解液于4°C，zui大轉(zhuǎn)速離心30 min后取上清；

2． 取少量裂解液以備Western blot分析，剩余裂解液加1μg相應(yīng)的抗體加入到細(xì)胞裂解液，4°C緩慢搖晃孵育過夜；
 

3． 取10 μl protein A 瓊脂糖珠，用適量裂解緩沖液洗3 次，每次3 000 rpm離心3 min；
 

4.． 將預(yù)處理過的10μl protein A 瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過夜的細(xì)胞裂解液中4°C緩慢搖晃孵育2-4 h，使抗體與protein A瓊脂糖珠偶連；
 

5． 免疫沉淀反應(yīng)后，在4°C 以3,000 rpm 速度離心3 min，將瓊脂糖珠離心至管底；將上清小心吸去，瓊脂糖珠用1 ml裂解緩沖液洗3－4次；zui后加入15 μl的2×SDS 上樣緩沖液，沸水煮5分鐘；
 

6． SDS-PAGE，Western blotting或質(zhì)譜儀分析。
 

三、通過免疫共沉淀確定結(jié)合蛋白
 

1．用磷酸鹽緩沖液洗30塊10 cm培養(yǎng)板上的適宜細(xì)胞。刮去每塊板上的細(xì)胞到1 ml冰冷的EBC裂解緩沖液中；
 

2．將每毫升細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到微量離心管中，在微量離心機上4℃以zui大速度離心15 ；

3．收集上清（約30 ml）并加入30 μg的適當(dāng)抗體，4℃搖動免疫沉淀物1 h；
 

4．加入0.9 ml的蛋白質(zhì)A-Sepharose 懸液，4℃搖動免疫沉淀物30 min；
 

5．用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物，再重復(fù)洗5次。zui后，用NETN洗一次；
 

6．吸出混合物的液體部分。加入800 μl的1×SDS膠加樣緩沖液到球珠中，煮沸4 min；

7．將樣品加入到大孔的不連續(xù)SDS-PAGE梯度膠中，在10 mA的恒定電流下電泳過夜；
 

8．通過考馬斯亮藍(lán)染色觀察蛋白質(zhì)泳帶；
 

9．從膠上切下目標(biāo)帶，將其放到微量離心管中，用1 ml 50%乙腈洗兩次，每次3 min；
 

10． 用胰蛋白酶消化膠中的蛋白質(zhì)，再將肽電洗脫；
 

11． 通過窄孔液相色譜分離肽。將收集的肽在ABI 477A或494A機器上進行自動Edman降解測序。
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注意事項 1. 細(xì)胞裂解采用溫和的裂解條件，不能破壞細(xì)胞內(nèi)存在的所有蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用，多采用非離子變性劑（NP40 或Triton X-100）。每種細(xì)胞的裂解條件是不一樣的，通過經(jīng)驗確定。不能用高濃度的變性劑（0.2％SDS），細(xì)胞裂解液中要加各種酶抑制劑，如商品化的。

2. 使用明確的抗體，可以將幾種抗體共同使用。

3. 使用對照抗體：

單克隆抗體：正常小鼠的IgG或另一類單抗

兔多克隆抗體：正常兔IgG

4. 確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的，而并非外源非特異蛋白，單克隆抗體的使用有助于避免污染的發(fā)生。

5. 要確保抗體的特異性，即在不表達(dá)抗原的細(xì)胞溶解物中添加抗體后不會引起共沉淀。

6. 確定蛋白間的相互作用是發(fā)生在細(xì)胞中，而不是由于細(xì)胞的溶解才發(fā)生的，這需要進行蛋白質(zhì)的定位來確定。

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其他 一、免疫共沉淀的優(yōu)點
 

1. 相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)。

2. 蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進行的，可以避免人為的影響。

3. 可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物。

二、免疫共沉淀的缺點
 

1. 可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用；

2. 兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用；

3. 必須在實驗前預(yù)測目的蛋白是什么，以選擇zui后檢測的抗體，所以，若預(yù)測不正確，實驗就得不到結(jié)果，方法本身具有冒險性。
 

三、RIPA Buffer配制
 

1. 基礎(chǔ)成分
 

Tris-HCl（緩沖液成分，防止蛋白變性）
 

NaCl（鹽份，防止非特異蛋白聚集）
 

NP-40（非離子去污劑，提取蛋白；用H2O配制成10%儲存液）
 

去氧膽酸鈉（離子去污劑，提取蛋白；用H2O配制成10%儲存液；避光保存）
 

注意：準(zhǔn)備激酶（致活酶）實驗時，不要加去氧膽酸鈉，因為離子型去污劑能夠使酶變性，導(dǎo)致活性喪失。
 

2. RIPA蛋白酶抑制劑
 

苯甲基磺酰氟（PMSF）（用異丙醇配制成200 mM的儲存液，室溫保存）
 

EDTA（鈣螯合劑；用H2O配制成100 mM的儲存液，PH 7.4）
 

亮抑酶肽（Leupeptin）（用H2O配制成1 mg/ml的儲存液，分裝，-20℃保存）
 

抑蛋白酶肽（Aprotinin）（用H2O配制成1 mg/ml的儲存液，分裝，-20℃保存）
 

胃蛋白酶抑制劑（Pepstatin）（用甲醇配制成1 mg/ml的儲存液，分裝，-20℃保存）
 

3. RIPA磷酸（酯）酶抑制劑
 

激活的Na3VO4（用H2O配制成200 mM的儲存液
 

NaF（200 mM的儲存液，室溫保存）
 

注意：在準(zhǔn)備做磷酸（酯）酶實驗的時候，不加磷酸酯酶抑制劑。
 

四、工作液配制
 

1. 配制100 ml的modified RIPA buffe
 

（1）稱取790 mg 的Tris-Base，加到75ml 去離子水中，加入900 mg的NaCl，攪拌，直到全部溶解，用HCl調(diào)節(jié)PH值到7.4。
 

（2）加10 ml 10%的NP-40。
 

（3）加2.5 ml 10%的去氧膽酸鈉，攪拌，直到溶液澄清。
 

（4）加1 ml 100mM的EDTA，用量筒定容到100 ml，2-8℃保存。
 

（5）理論上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制劑應(yīng)該在使用當(dāng)天同時加入（抑蛋白酶肽、亮抑酶肽、胃蛋白酶抑制劑各100 μl；PMSF、Na3VO4、 NaF各500 μl），但是PMSF在水溶液中很不穩(wěn)定，30分鐘就會降解一半，所以PMSF應(yīng)該在使用前現(xiàn)加，其他抑制劑成分可以在水溶液中穩(wěn)定5天。