久久亚洲精品天码av,午夜福利屄插穴,午夜福利视频91,亚欧美爽爽爽爽爽,亚洲欧美日韩色色图片,青青操在线观看,精品天堂麻豆av,无码av东京热,婷婷成人亚洲少妇

TNF包括TNFα與TNFß兩型，它們具有極其相似的生物學(xué)活性，在體內(nèi)外可對一些腫瘤細(xì)胞或細(xì)胞系起殺傷作用，而對正常細(xì)胞則無細(xì)胞毒效應(yīng)。根據(jù)這一特點，可利用TNF對敏感靶細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)，在體外檢測TNF的活性水平，既可檢測分泌型TNF（sTNF），也可檢測膜結(jié)合型TNF（mTNF）。zui常用的方法是體外檢測TNF對小鼠成纖維瘤細(xì)胞（L929細(xì)胞）的細(xì)胞毒效應(yīng)。
【基本原理】
TNF對L929細(xì)胞有細(xì)胞毒作用，如同時加用轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D，則可提高L929細(xì)胞對TNF的敏感性10～100倍。利用染料結(jié)晶紫或MTT可使活細(xì)胞染色，再用脫色液將染料脫出，測定其OD值，即可反應(yīng)細(xì)胞的存活狀態(tài)或TNF對L929細(xì)胞的殺傷率，通過計算細(xì)胞死亡率，并與sTNF標(biāo)準(zhǔn)品對照，即可檢測待測樣品sTNF活性單位。
【材料和試劑】
（1） L929細(xì)胞株（存活率應(yīng)＞95%）
（2） TNF標(biāo)準(zhǔn)品：作倍比稀釋（100 U/ml～0.1 U/ml）。
（3） 待測樣品：作倍比稀釋至少6個不同稀釋度。
（4） 0.25%胰蛋白酶
（5） RPMI-1640培養(yǎng)液及PBS
（6） 0.25%結(jié)晶紫（溶于20%甲醇中），或者5mg/ml MTT（溶于PBS中）
（7） 放線菌素D（分存液濃度為100 ug/ml）
（8） 檸檬酸鈉緩沖液（0.9%檸檬酸鈉，0.02mol/L鹽酸，47.5%乙醇，為脫色液）；酸化異丙醇（0.04mol/L HCL異丙醇）
（9） 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，刻度吸管，毛細(xì)吸管，加樣器（頭），刻度離心管，離心機(jī)，細(xì)胞計數(shù)板，倒置顯微鏡，超凈工作臺，CO2培養(yǎng)箱。
（10） 酶標(biāo)測定儀，570nm濾光片，630nm濾光片。
【操作步驟】
（1） 取對數(shù)生長期的L929細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化2-3min，然后洗滌細(xì)胞2次，以去除消化液及原生長培養(yǎng)液；
（2） 用RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)L929細(xì)胞濃度為2×105/ml；
（3） 將上述細(xì)胞懸液加至96孔培養(yǎng)板，100 ul/孔；
（4） 置37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；
（5） 吸去細(xì)胞培養(yǎng)上清液后，各孔分別加入倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品，100ul/孔，各設(shè)雙復(fù)孔，并設(shè)培養(yǎng)液陰性對照及空白對照（即L929細(xì)胞、標(biāo)準(zhǔn)品及待測樣品均不加入，僅加培養(yǎng)液）；
（6） 同時向各孔均加入10ul放線菌素D（0.5～1μg/孔）；
（7） 置37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-14h；
（8） 甩棄上清，并用RPMI-1640培養(yǎng)液洗細(xì)胞1次；
（9） 每孔均加入0.25%結(jié)晶紫，100μl/孔，室溫下染色10min；
（10） 甩棄上清，再用PBS洗板3次；
（11） 室溫下涼干，加入檸檬酸鈉緩沖液脫色，100μl/孔；
（12） 充分混勻后，用酶標(biāo)儀以檢測波長570nm，參考波長630nm測各孔OD值。