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TNF包括TNFα與TNFß兩型，它們具有極其相似的生物學活性，在體內(nèi)外可對一些腫瘤細胞或細胞系起殺傷作用，而對正常細胞則無細胞毒效應(yīng)。根據(jù)這一特點，可利用TNF對敏感靶細胞的細胞毒效應(yīng)，在體外檢測TNF的活性水平，既可檢測分泌型TNF（sTNF），也可檢測膜結(jié)合型TNF（mTNF）。zui常用的方法是體外檢測TNF對小鼠成纖維瘤細胞（L929細胞）的細胞毒效應(yīng)。
【基本原理】
TNF對L929細胞有細胞毒作用，如同時加用轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D，則可提高L929細胞對TNF的敏感性10～100倍。利用染料結(jié)晶紫或MTT可使活細胞染色，再用脫色液將染料脫出，測定其OD值，即可反應(yīng)細胞的存活狀態(tài)或TNF對L929細胞的殺傷率，通過計算細胞死亡率，并與sTNF標準品對照，即可檢測待測樣品sTNF活性單位。
【材料和試劑】
（1） L929細胞株（存活率應(yīng)＞95%）
（2） TNF標準品：作倍比稀釋（100 U/ml～0.1 U/ml）。
（3） 待測樣品：作倍比稀釋至少6個不同稀釋度。
（4） 0.25%胰蛋白酶
（5） RPMI-1640培養(yǎng)液及PBS
（6） 0.25%結(jié)晶紫（溶于20%甲醇中），或者5mg/ml MTT（溶于PBS中）
（7） 放線菌素D（分存液濃度為100 ug/ml）
（8） 檸檬酸鈉緩沖液（0.9%檸檬酸鈉，0.02mol/L鹽酸，47.5%乙醇，為脫色液）；酸化異丙醇（0.04mol/L HCL異丙醇）
（9） 96孔細胞培養(yǎng)板，刻度吸管，毛細吸管，加樣器（頭），刻度離心管，離心機，細胞計數(shù)板，倒置顯微鏡，超凈工作臺，CO2培養(yǎng)箱。
（10） 酶標測定儀，570nm濾光片，630nm濾光片。
【操作步驟】
（1） 取對數(shù)生長期的L929細胞，用0.25%胰蛋白酶消化2-3min，然后洗滌細胞2次，以去除消化液及原生長培養(yǎng)液；
（2） 用RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)L929細胞濃度為2×105/ml；
（3） 將上述細胞懸液加至96孔培養(yǎng)板，100 ul/孔；
（4） 置37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；
（5） 吸去細胞培養(yǎng)上清液后，各孔分別加入倍比稀釋的標準品和待測樣品，100ul/孔，各設(shè)雙復孔，并設(shè)培養(yǎng)液陰性對照及空白對照（即L929細胞、標準品及待測樣品均不加入，僅加培養(yǎng)液）；
（6） 同時向各孔均加入10ul放線菌素D（0.5～1μg/孔）；
（7） 置37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-14h；
（8） 甩棄上清，并用RPMI-1640培養(yǎng)液洗細胞1次；
（9） 每孔均加入0.25%結(jié)晶紫，100μl/孔，室溫下染色10min；
（10） 甩棄上清，再用PBS洗板3次；
（11） 室溫下涼干，加入檸檬酸鈉緩沖液脫色，100μl/孔；
（12） 充分混勻后，用酶標儀以檢測波長570nm，參考波長630nm測各孔OD值。