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【操作步驟】
（1）取對數(shù)生長期的L929細胞，用0.25%胰蛋白酶消化2-3min，然后洗滌細胞2次，以去除消化液及原生長培養(yǎng)液；
（2）用RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)L929細胞濃度為2×105/ml；
（3）將上述細胞懸液加至96孔培養(yǎng)板，100 ul/孔；
（4）置37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；
（5）吸去細胞培養(yǎng)上清液后，各孔分別加入倍比稀釋的標準品和待測樣品，100ul/孔，各設(shè)雙復(fù)孔，并設(shè)培養(yǎng)液陰性對照及空白對照（即L929細胞、標準品及待測樣品均不加入，僅加培養(yǎng)液）；
（6）同時向各孔均加入10ul放線菌素D（0.5～1μg/孔）；
（7）置37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-14h；
（1） 直接于每孔中加入MTT溶液，10μl/孔 ，37℃孵育4h；
（2） 從每孔中輕輕吸出培養(yǎng)上清液100μl/孔 ，棄去 ，再于每孔中加入酸化異丙醇或DMSO，100μl/孔，混勻，置室溫10min；
（3） 用酶標儀以檢測波長570nm，參考波長630nm分別測各孔OD值。
【結(jié)果分析】
（1） 取雙復(fù)孔平均值，各孔OD值為OD570nm-OD630nm，再減去空白對照OD值。
（2） 根據(jù)各孔OD值，分別計算出各稀釋度的標準品和待測樣品對應(yīng)的L929細胞死亡率。可按下式計算：
各孔細胞死亡率 = 陰性對照孔OD-含TNF孔OD × 100%
陰性對照孔OD

（3）以Log2[稀釋度]為橫座標（X），以細胞死亡率（%）為縱座標（Y），分別繪制標準曲線和待測樣品曲線，根據(jù)導(dǎo)致50%細胞死亡的標準品和待測樣品曲線，根據(jù)導(dǎo)致50%細胞死亡的標準品和待測樣品稀釋度，按下式計算樣本TNF的活性單位：
TNF的活性單位
（U/ml） = 標準品導(dǎo)致50%細胞死亡的待測樣品稀釋度 × 標準品活性單位
（U/ml）
導(dǎo)致50%細胞死亡的標準品稀釋度

（4）亦可根據(jù)正態(tài)概率紙法和概率單位法求得待測樣品TNF活性單位，可參見IL-1、IL-2的生物活性檢測部分及醫(yī)學(xué)統(tǒng)計學(xué)的有關(guān)內(nèi)容。
【注意事項】
（1） L929細胞要充分洗滌，以去除原培養(yǎng)液，同時應(yīng)均勻分布于各孔中，以免影響檢測結(jié)果。
（2） L929細胞不宜生長過密，只要孔內(nèi)長成單層即可使用。
（3） L929細胞存活率應(yīng)＞95%。
（4） L929細胞隨著傳代或受其他因素影響，對放線菌素D的敏感性會有差異，應(yīng)先作預(yù)試驗確定其使用濃度。
（5） 倍比稀釋TNF標準品和待測樣品時，應(yīng)以1:2開始至少6個稀釋度。
（6） MTT染色，其著色深淺不但與細胞數(shù)有關(guān)，還與細胞激活有關(guān)。如某種因素激活細胞后，其代謝率將增強，線粒體琥珀酸脫氫酶活性亦增強，著色也將加深。因此MTT染色時，應(yīng)考慮待測樣品中是否含有能激活靶細胞的因素存在。
（7） 加入酸化異丙醇后，應(yīng)在1h內(nèi)測定各孔OD值。
（8） 本法亦可適用于待測細胞mTNF的檢測。