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使用顯微圖像分析系統(tǒng)處理顯微圖像時(shí)，使用者實(shí)際操作很少，幾乎*是通過鼠標(biāo)來操縱復(fù)雜的運(yùn)行過程，計(jì)算機(jī)軟件可按實(shí)際需要行使其功能。計(jì)算機(jī)屏幕上顯示多項(xiàng)指令，由鼠標(biāo)指明你所需要的程序即可。雖然不同品牌和不同型號(hào)的顯微圖像分析系統(tǒng)的具體性能參數(shù)不同，但在使用中基本處理過程相同．區(qū)別只在于對(duì)顯微圖像的不同采集參數(shù)和處理軟件的設(shè)定和使用上。顯微圖像處理的基本過程包括制作切片樣品、獲取圖像、圖像分割、目標(biāo)測量、統(tǒng)計(jì)分析和結(jié)果輸出。

《一》制作切片樣品
顯微圖像分析系統(tǒng)所用的切片與常規(guī)組織學(xué)切片的制作方法及要求基本相同，可根據(jù)研究者的目的選擇適當(dāng)類型切片。

《二》獲取圖像
通過顯微鏡將切片圖像放大，成像在攝像機(jī)上，完成光／電轉(zhuǎn)換，再經(jīng)模／數(shù)轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)輸入計(jì)算機(jī)。在計(jì)算機(jī)屏幕上顯示的數(shù)字化顯微圖像由于各種原因（如：圖像采集卡的性能、顯微鏡及光源等）都會(huì)對(duì)圖像產(chǎn)生影響，難以獲取真實(shí)的目標(biāo)信息，所以要通過合理的軟件處理使原始數(shù)字圖像得到適當(dāng)變化，以適應(yīng)人的視覺信息和獲取特性，更便于圖像目標(biāo)信息的提取。

《三》圖像分割
圖像分割是將圖像中需要測量的目標(biāo)從背景中分割出來，以便于計(jì)算機(jī)對(duì)分割出來的圖形進(jìn)行測定分析。圖像分割的基本要求是分割出來的圖形或區(qū)域必須與原來的目標(biāo)大小及形態(tài)相吻合，因此，圖像分割的好壞是決定測量精度的關(guān)鍵因素之一。設(shè)法從圖像中確定并且分離出需要分析灰度相的步驟，稱閾值分割。“相”（phase）是圖像中我們想要測量部分的總稱。測量需通過選擇一定閾值來完成，如果所需相比背景暗，那么，所有暗于下限的圖像均被選人。例如相的灰度是20～50，20是下限，50是上限，背景的灰度小于20，檢測時(shí)暗于灰度20的圖形均被選人。如果所需相比背景亮，如免疫熒光細(xì)胞化學(xué)制作的標(biāo)本，那么，亮于上限的圖像均被選人。例如相的灰度是5～20，5是下限，20是上限，背景灰度大于20，灰度20以下的相被選人，而背景是暗于上限的，不被選作測量。如果相暗于圖像某些部分而又亮于圖像的另一些部分，則需在兩限之間的部分選擇灰度。
在檢測過程中要使用圖像框（image frame）和測量框（measurement frame）。檢測只在圖像框內(nèi)進(jìn)行，框的大小根據(jù)需要而定，測量框在圖像框之內(nèi)，是進(jìn)行測量的部位。兩個(gè)框之間的部分稱為保險(xiǎn)區(qū)。圖像中每個(gè)被測物均有其特征計(jì)算點(diǎn)（feature count point，F(xiàn)CP），三在被測物的zui低點(diǎn)，被測物的特征計(jì)算點(diǎn)均應(yīng)在測量框內(nèi)，有的被測物可能被測量框截?cái)?。那么測量框外的那部分被測物應(yīng)該位于保險(xiǎn)區(qū)，即保險(xiǎn)區(qū)要大于被測物所占的位置，才能觀察特征計(jì)算點(diǎn)是否在測量框內(nèi)而決定取舍。這樣當(dāng)換到相鄰的區(qū)域進(jìn)行測量時(shí)，不會(huì)使某圖形重復(fù)測量，可避免測量誤差。選擇好目標(biāo)圖像后，計(jì)算機(jī)控制按一定方式移動(dòng)放置標(biāo)本的顯微鏡載物臺(tái)，每個(gè)部位都將通過測量框，不會(huì)遺漏。

《四》測量
測量是對(duì)目標(biāo)圖形的定量描述。只有選擇合適的特征參數(shù)才能更好地反映目標(biāo)圖形的各項(xiàng)性質(zhì)，使研究者做出正確的判斷。常選取目標(biāo)圖形的灰度、面積、長度、周長、光密度和光強(qiáng)度等作為特征參數(shù)。原始參數(shù)可由計(jì)算機(jī)轉(zhuǎn)化成容易理解的數(shù)值，例如，面積可由某圖形所占像素?cái)?shù)轉(zhuǎn)化為平方微米，使觀察者容易理解。

《五》統(tǒng)計(jì)分析
依據(jù)所得的數(shù)據(jù)類型，選擇正確的統(tǒng)計(jì)分析方法進(jìn)行分析。

《六》結(jié)果輸出
通過以上各步驟，得出zui終的所需結(jié)果。
以上介紹了圖像分析系統(tǒng)的基本概念和顯微圖像分析處理程序，下面舉例說明在免疫組織化學(xué)定量分析中圖像分析系統(tǒng)的作用。如欲揭示不同條件下大鼠海馬CA：區(qū)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白（星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志性蛋白）免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量的變化，對(duì)免疫組織化學(xué)染色的大鼠腦海馬切片進(jìn)行顯微圖像分析。在每只大鼠切片的海馬CA，區(qū)隨意選取10個(gè)視野，測定每個(gè)視野內(nèi)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白（GFAP）免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)量、胞體截面積、周長、平均光密度及積分光密度，再求出它們的平均值及標(biāo)準(zhǔn)誤（其中陽性細(xì)胞數(shù)是在目鏡為15倍，物鏡20倍的顯微鏡下，用目鏡測微器計(jì)算100個(gè)方格內(nèi)細(xì)胞數(shù)得出的）。分析結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組陽性細(xì)胞數(shù)量約增加0．48倍、胞體截面積約增加1．73倍、周長約增加1．09倍、平均光密度約增加0．20倍、積分光密度約增加2．31倍。所得數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果表明：實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，差異有極顯著性意義（P<0．01）。