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PCR診斷弓形蟲病
發(fā)布時間：2011-2-26PCR檢測 謝德華等（2005）以核糖體DNA*內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（1TSl）序列作為弓形蟲種特異的遺傳標(biāo)記，建立了豬弓形蟲病特異PCR診斷方法。
套式PCR（nestedPCR） 設(shè)計兩對引物，外引物含有內(nèi)引物的部分序列，經(jīng)兩次擴(kuò)增，大大提高了PCR的敏感性和特異性。糜祖煌以兩對月J基因引物建立了套式PCR擴(kuò)增弓形蟲基因，發(fā)現(xiàn)套式PCR比普通PCR敏感兩個數(shù)量級。Martinez等（2003）用套式PCR-ELISA檢測弓形蟲DNA，確定檢測閾值并與Southern印跡相對比，將雜交時間及探針濃度標(biāo)準(zhǔn)化，認(rèn)為PCRELISA法可以作為弓形蟲常規(guī)檢測試驗。Vidigal等（2002）用套式PCP,檢測丁86例羊水，敏感度為62．5％，特異度為97．4％。Fuentes等（1996）報道以尿液進(jìn)行嬰兒先天性弓形蟲病的產(chǎn)前診斷，用巢式PCR進(jìn)行診斷，結(jié)果表明，在嬰兒先天性弓形蟲感染的確診中是一種非常有用的方法。鄭蘭艷等（2000）應(yīng)用ELISA—PCR檢測弓形蟲循環(huán)抗原研究認(rèn)為此方法是一種特異性強、敏感性高弓形蟲的檢測方法，其敏感性較ELISA方法提高了200倍并且認(rèn)為此方法檢出陽性結(jié)果時間早等優(yōu)點。另外，Jones等（2000）用P30、B1和rDNA三種靶序列來設(shè)計引物，通過套式PCR檢測眼房水弓形蟲DNA的方法來比較三者之間的敏感性，結(jié)果說明以月J基因作為靶基因的PCR是zui敏感的方法。
定量競爭PCR（quantitiativecompetitivePCR） 設(shè)計與目的基因有相同引物結(jié)合部位（同源性競爭模板）或有不同引物結(jié)合部位（異源性競爭模板）的內(nèi)參照，通過擴(kuò)增后內(nèi)參照的DNA產(chǎn)物含量來推算標(biāo)本中目的DNA或mRNA的含量。Lee（1999）設(shè)計了含4個引物結(jié)合位點的人工競爭物的定量競爭套式PCR檢測方法，競爭物可作為定量的參照，又可以檢測假陰性結(jié)果。Homan等（2000）用529bp重復(fù)序列作為靶基因檢測弓形蟲病原。
多重PCR（multiplexPCR） 為了同時檢測幾種病原體而在一個反應(yīng)體系中加入多對引物以擴(kuò)增不同的DNA片段，操作快速簡便。Roberts（1997）用多重PCR同時檢測AIDS患者腦脊液中弓形蟲及EB病毒，達(dá)到鑒別診斷的目的。
原位PCR（insitu PCR） 在組織切片或細(xì)胞涂片的原位對DNA或RNA進(jìn)行擴(kuò)增，將原位雜交的定位性與PCR的高敏感性結(jié)合起來，省卻了提取DNA的煩瑣步驟，可以同時觀察組織病變、進(jìn)行蟲體定位、動態(tài)觀察蟲體的感染情況。李爽等（2000）用原位PCR方法檢測了10例弓形蟲感染的病理標(biāo)本，陽性率100％。
熒光定量PCR（FQ-PCR） 可采用與DNA雙鏈特異性結(jié)合的熒光染料（SYBRGreen 1），熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）的雜交探針技術(shù)及水解探針模式（即Taqman技術(shù)）。探針熒光信號的強度隨基因量的增加而增加，從而達(dá)到定量的目的。試驗采用閉管操作，避免了后處理時易出現(xiàn)的污染；實時定量檢測克服了傳統(tǒng)PCR方法的平臺效應(yīng)。Bretagne（2003）建立了實時PCR方法，自動抽提DNA，并將其標(biāo)準(zhǔn)化，使得實驗室間的結(jié)果對比及質(zhì)量控制成為可能。Ma等（2003）用熒光定量PCR的方法檢測了70位感染弓形蟲的孕婦的羊水和／或臍帶血以診斷胎兒感染，證明了母親感染弓形蟲DNA含量越高，胎兒感染率越高。Lin等（2003）以寡核苷酸為引物，建立了以熒光標(biāo)記的Taqman探針擴(kuò)增弓形蟲B1基因的實時PCR方法，可以檢測出含o．05個速殖子的標(biāo)本。
逆轉(zhuǎn)錄PCR（RTPCR） 以RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，由人工合成的引物介導(dǎo)生成cDNA模板，在TaqDNA聚合酶作用下，擴(kuò)增產(chǎn)生大量的特異性DNA片段。Cultrera等（2002）用RT—PCR檢測人標(biāo)本中慢殖子的表達(dá)，從而區(qū)分急性感染或者慢性感染，擴(kuò)增MAGl、SAG4、SAGl基因以達(dá)到區(qū)分不同感染階段的目的。