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原位雜交
發(fā)布時間：2010-12-18用特定標記的已知序列核酸作為探針與細胞或組織切片中核酸進行雜交并對其實行檢測的方法稱為核酸原位雜交（nucleic acid hybridizationin situ）。該技術(shù)zui早應(yīng)用于20世紀60年代末期。由于核酸分子雜交的特異性高，并可定位，因此該技術(shù)已廣泛地應(yīng)用于醫(yī)學分子生物學研究。例如用標記的探針與分裂中期染色體DNA雜交以研究染色質(zhì)中特定核酸序列在染色體中的定位；用特異性的細菌、病毒的核酸作為探針對組織與細胞進行雜交，以確定有無該病原體的感染等。原位雜交能在成分復雜的組織中進行單一細胞的研究而不受同一組織中其他成分的影響，因此對于那些細胞數(shù)量少且散在于其他組織中的細胞內(nèi)DNA或RNA研究更為方便；同時由于原位雜交不需要從組織中提取核酸，對于組織中含量極低的靶序列有*的敏感性，并可完整地保持組織與細胞的形態(tài)，更能準確地反映出組織細胞的相互關(guān)系及功能狀態(tài)。
核酸包括組織細胞的固定、預雜交、雜交、沖洗及信號檢測等基本步驟。
（一）組織或細胞的固定
是在載玻片上進行的，因此進行的*步就是將組織或細胞固定在載玻片上。常用于核酸的固定液有10％甲醛、4％多聚甲醛、乙醇：冰醋酸（3：1）、戊二醛、Garnoy固定液、Bouin固定液等。這些固定液都有不同的優(yōu)缺點，因此要根據(jù)具體的實驗對象選擇*的固定液。
（二）組織細胞雜交前的預處理
固定到載玻片上的組織細胞中的核酸是與細胞內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)合在一起的，這種核酸蛋白質(zhì)復合體會影響探針與核酸的結(jié)合，因此，降解核酸表面的蛋白質(zhì)是雜交前預處理的關(guān)鍵。一般采用去垢劑和（或）蛋白酶對組織細胞進行部分性的消化，使探針在細胞基質(zhì)中獲得zui大的穿透力。常用的去垢劑有TritonX—100和十二烷基磺酸鈉（SDS），常用的蛋白酶為蛋白酶K。所選用的蛋白酶中不能含有核酸酶；消化組織細胞的時間不能過長，否則會導致細胞結(jié)構(gòu)破壞或使核酸從載玻片上脫落。
（三）探針的選擇和標記
中所用的探針可以是DNA探針、RNA探針、寡核苷酸探針等，一般標記的DNA或RNA探針的長度以50—300bp為好，這個長度的探針在組織細胞中的穿透力好。雙鏈DNA探針是zui常用的探針之一，但雜交時濃度高了易引起探針之間互補鏈的退火；用M1：克隆載體可制備單鏈cDNA探針，其zui大的優(yōu)點就是不會產(chǎn)生探針自身退火；人工合成的寡核苷酸分子量小，穿透力大，且可在基因序列的多部位設(shè)計探針以選擇*序列；反義RNA探針是以DNA為模板轉(zhuǎn)錄出的RNA鏈，特異性強，不存在探針自身退火的問題。
用于原位核酸雜交的探針既可用核素標記，也可用非核素標記。核素標記的核酸探針敏感性高，但雜交信號的檢測有時需要較長的時間，如3H標記的探針雜交曝光時間需要數(shù)周或數(shù)月。與放射性核素標記的探針相比，非放射性探針具有安全、無放射性污染、穩(wěn)定性好、顯色快而易于觀察等優(yōu)點，近年來得到了廣泛的應(yīng)用。
（四）雜交
在載玻片上進行，雜交液的體積應(yīng)盡量小，一般每張切片用10～20／11雜交液。cDNA和RNA探針的雜交溫度大約為50℃。DNA探針的雜交可在2—4h內(nèi)完成，而RNA探針的雜交則應(yīng)過夜。如果靶分子是細胞內(nèi)的DNA，應(yīng)將組織切片加熱至95℃5—15min，使靶DNA變性。雜交后的沖洗溫度一般不高于50℃，以免使組織細胞結(jié)構(gòu)破壞或脫落。用反義RNA探針雜交時，雜交后用RNA酶消化單鏈RNA以降低本底。
（五）雜交結(jié)果檢測
若應(yīng)用的是放射性核素標記探針，雜交后必須經(jīng)過放射自顯影，對被檢測的核酸進行定位與定量；若應(yīng)用的是非放射性標記的探針，則根據(jù)標記體系對雜交結(jié)果進行檢測，例如生物素標記的探針檢測主要用抗生物素抗體和親和素檢測。