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ELISA法檢測腫瘤壞死因子
發(fā)布時間：2010-10-27腫瘤壞死因子（TNF）是由激活的單核細胞巨噬細胞受內(nèi)毒素刺激后產(chǎn)生的一種分子量為17 000的蛋白質(zhì)。其中，由巨噬細胞產(chǎn)生的稱TNF-α，是巨噬細胞介導(dǎo)細胞毒效應(yīng)的細胞因子；由淋巴細胞產(chǎn)生的稱TNF-β。TNF在體內(nèi)具有廣泛的生物學(xué)活性：可作為免疫應(yīng)答中的一種中間介質(zhì)，既有抗病效應(yīng)，又有致病效應(yīng)；可引起腫瘤的出血壞死；可刺激成纖維細胞增殖；可增加HLA-A、HLA-B、HLA-C抗原的表達；可激活中性粒細胞及殺傷細胞；可促進B細胞增殖及分化、增加IL-2受體表達。肝臟是TNF的主要發(fā)源地，同時也是TNF清除的主要部位。目前，以TNF-α在臨床的意義較大，是內(nèi)毒素引起肝損害的重要介質(zhì)。TNF-α只有通過與靶細胞表面的膜型受體（mTNF-aR）特異結(jié)合才能發(fā)揮毒性效應(yīng)，這一結(jié)合過程又
受血清中可溶性TNF-α受體（sTNF-aR）的調(diào)節(jié)和制約，而sTNF-aR可與mTNF-aR競爭結(jié)合TNF-。。臨床上常以檢測TNF-α為主。
[檢測方法] ELISA法
[方法學(xué)原理] 在微孔反應(yīng)板上包被抗人TNF-α單克隆抗體，待測標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)品中的TNF-a會與單克隆抗體結(jié)合，游離的成分被洗去，同時加入生物素化的抗人TNF-α抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素。生物素與親和素特異結(jié)合，抗人TNF抗體與結(jié)合在單克隆抗體上的人TNF-α結(jié)合而形成免疫復(fù)合物，游離的成分被洗去。加入顯色劑，若反應(yīng)孔中有TNF-α，HRP會使無色的顯色劑呈現(xiàn)藍色，加終止液變黃色。在波長450nm處測吸光度，TNF濃度與吸光度成正比，可通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中的TNF-α濃度。
[標(biāo)本準(zhǔn)備] 靜脈血2ml，不抗凝。
[試劑]
1．預(yù)包被微孔反應(yīng)板
2．濃縮酶結(jié)合物
3．酶結(jié)合物稀釋液
4．標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本稀釋液
5．濃縮生物素化抗體
6．IFN標(biāo)準(zhǔn)晶
7．濃縮洗滌液
8．顯色劑A、B
9．終止液
[儀器] 酶標(biāo)儀或全自動酶聯(lián)免疫檢測儀。
[檢測步驟]
1．在微孔反應(yīng)板相應(yīng)孔中分別加入待測樣本、不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品100txl，再加生物素化抗體工作液50tzl。
2．振蕩混勻，置20-25℃環(huán)境中溫育120min。
3．將孔內(nèi)液體吸干，用洗滌液充分洗滌5次，干燥。
4．除空白孔外，加入酶結(jié)合物工作液100u1。
5．振蕩混勻，置20-25℃環(huán)境中溫育30min。
6．將孔內(nèi)液體吸干，用洗滌液充分洗滌5次，干燥。
7．每孔加入顯色劑A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37C環(huán)境中避光顯色10min。
8．加入終止液50ul后，輕輕振蕩混勻。用酶標(biāo)儀（450nm波長）測定各孔吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對照，求出TNF值。
[正常參考值] 各實驗室可根據(jù)檢測方法的不同確立正常參考值。
[注意事項]
1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出時應(yīng)在室溫環(huán)境中平衡30min后方可使用，未用完的微孔條用自封袋密封保存。
2。酶標(biāo)板洗滌時各孔均需加滿洗滌液，防止孔內(nèi)有游離酶不能洗凈。應(yīng)設(shè)定30～60s的洗滌浸泡時間。
3．滴加試劑前應(yīng)將滴瓶翻轉(zhuǎn)數(shù)次，使液體混勻。滴加時瓶身應(yīng)保持垂直，以使滴量準(zhǔn)確。
4．所有樣品和廢棄物都應(yīng)按傳染源處理。終止液為2mol／L硫酸，使用時應(yīng)注意安全。
5．每批樣本應(yīng)同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
6．若標(biāo)本OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線測定范圍以外，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測。