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常用的色譜分離方法

在生物大分子純化分析特別是蛋白質(zhì)純化分析中，色譜是非常重要而且常用的一種技術(shù)。

一、凝膠過濾

凝膠過濾又叫分子篩色譜，其原因是凝膠具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，小分子物質(zhì)能進入其內(nèi)部，而大分子物質(zhì)卻被排除在外部。當(dāng)一混合溶液通過凝膠過濾色譜柱時，溶液中的物質(zhì)就按不同分子量篩分開了。

二、離子交換色譜

離子交換色譜是在以離子交換劑為固定相，液體為流動相的系統(tǒng)中進行的。離子交換劑是由基質(zhì)、電荷基團和反離子構(gòu)成的。離子交換劑與水溶液中離子或離子化合物的反應(yīng)主要以離子交換方式進行，或借助離子交換劑上電荷基團對溶液中離子或離子化合物的吸附作用進行。

三、吸附色譜

1、 吸附柱色譜

吸附柱色譜是以固體吸附劑為固定相，以有機溶劑或緩沖液為流動相構(gòu)成柱的一種色譜方法。

2、 薄層色譜

薄層色譜是以涂布于薄板或滌綸片等載體上的基質(zhì)為固定相，以液體為流動相的一種色譜方法。這種色譜方法是把吸附劑等物質(zhì)涂布于載體上形成薄層，然后按紙色譜操作進行展層。

3、 聚酰胺薄膜色譜

聚酰胺對極性物質(zhì)的吸附作用是由于它能和被分離物之間形成氫鍵。這種氫鍵的強弱就決定了被分離物與聚酰胺薄膜之間吸附能力的大小。色譜時，展層劑與被分離物在聚酰胺膜表面競爭形成氫鍵。因此選擇適當(dāng)?shù)恼箤觿┦狗蛛x在聚酰胺膜表面發(fā)生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的連續(xù)過程，就能導(dǎo)致分離物質(zhì)達(dá)到分離目的。

四、 親和色譜

親和色譜是根據(jù)生物大分子和配體之間的特異性親和力，將某種配體連接在載體上作為固定相，而對能與配體特異性結(jié)合的生物大分子進行分離的一種色譜技術(shù)。親和色譜是分離生物大分子zui為有效的色譜技術(shù)，分辨率很高。

親和色譜的原理與的抗原一抗體、激素一受體和酶一底物等特異性反應(yīng)的機理相類似，每對反應(yīng)物之間都有一定的親和力。正如在酶與底物的反應(yīng)中，特異的廢物（S''）才能和一定的酶（E）結(jié)合，產(chǎn)生復(fù)合物（E－S''）一樣。在親和色譜中是特異的配體才能和一定的生命大分子之間具有親和力，并產(chǎn)生復(fù)合物。而親和色譜與酶一底物反應(yīng)不同的是，前者進行反應(yīng)時，配體（類似底物）是固相存在；后者進行反應(yīng)時，底物呈液相存在。實質(zhì)上親和色譜是把具有識別能力的配體L（對酶的配體可以是類似底物、抑制劑或輔基等）以共價鍵的方式固化到含有活化基團的基質(zhì)M（如活化瓊脂糖等）上，制成親和吸附劑M－L，或者叫做固相載體。而固化后的配體仍保持束縛特異物質(zhì)的能力。

因此，當(dāng)把圍相載體裝人小色譜柱（幾毫升到幾十毫升床體積）后，讓欲分離的樣品液通過該柱。這時樣品中對配體有親和力的物質(zhì)S就可借助靜電引力、范德瓦爾力，以及結(jié)構(gòu)互補效應(yīng)等作用吸附到固相載體上，而無親和力或非特異吸附的物質(zhì)則被起始緩沖液洗滌出來，并形成了*個色譜峰。然后，恰當(dāng)?shù)馗淖兤鹗季彌_ 液的PH值、或增加離子強度、或加人抑③劑等因子，即可把物質(zhì)S從固相載體上解離下來，并形成了第M個色譜峰（見圖6－2）。顯然，通過這一操作程序就可把有效成分與雜質(zhì)滿意地分離開。如果樣品液中存在兩個以上的物質(zhì)與固相載體具有親和力（其大小有差異）時，采用選擇性緩沖液進行洗脫，也可以將它們分離開。用過的固相載體經(jīng)再生處理后，可以重復(fù)使用。

上面介紹的親和色譜法也是特異性配體親和色譜法。另外還有通用性配體親和色譜法。這兩種親和色譜法相比，前者的配體一般為復(fù)雜的生命大分子物質(zhì)（如抗體、受體和酶的類似底物等），它具有較強的吸附選擇性和較大的結(jié)合力。而后者的配體則一般為簡單的小分子物質(zhì)（如金屬、染料，以及氨基酸等），它成本低廉、具有較高的吸附容量，通過改善吸附和脫附條件可提高色譜的分辨率。