2024年7月，日本煙草公司制藥研究所的Toshiki Urashima研究團隊在《BPB Reports》上發(fā)表了一篇題為“Tapinarof, a Novel Topical Therapeutic Aryl Hydrocarbon Receptor Agonist, Suppresses Atopic Dermatitis-like Skin Inflammation in Mice"的研究文獻。該研究探究了新型外用芳香烴受體激動劑Tapinarof的藥理學特性，以及其在2,4-二硝基氟苯誘導的特應性皮炎樣皮膚炎癥小鼠模型中的治療效果。

摘要

本維莫德是一種非甾體類小分子芳香烴受體激動劑，目前正被研發(fā)用于治療特應性皮炎。特應性皮炎是一種由2型輔助性T（Th2）細胞介導的慢性炎癥性皮膚病，其特征為表皮分化障礙和皮膚屏障功能受損。已有研究表明，Tapinarof可通過激活AhR調(diào)控靶基因表達，改善皮膚屏障功能并發(fā)揮抗氧化作用。本研究探究了Tapinarof的藥理學特性，以及其在DNFB誘導的AD樣皮膚炎癥小鼠中的療效。在經(jīng)T細胞激活劑刺激的人外周血單個核細胞中，Tapinarof可誘導AhR激活的標志物CYP1A1的mRNA表達，同時誘導抗氧化酶NAD(P)H:醌氧化還原酶的mRNA表達，還能抑制Th2細胞因子白介素（IL）-4的產(chǎn)生。在AD樣皮炎小鼠中，外用Tapinarof可促進皮膚中Cyp1a1和Nqo1的表達，抑制IL-4的產(chǎn)生、耳部腫脹及組織病理學改變，同時還能抑制作為皮膚屏障功能指標的經(jīng)皮水分流失升高。這些結(jié)果表明，Tapinarof可抑制AD樣皮膚炎癥，其作用可能涉及抗氧化、抑制Th2細胞因子產(chǎn)生以及改善皮膚屏障功能等多種藥理作用。

實驗材料與儀器

材料

Tapinarof、FK506一水合物、乙醇、二甲基亞砜、2,4-二硝基氟苯

冷凍保存的人外周血單個核細胞。

動物：6周齡雌性BALB/c小鼠。

試劑盒與試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基、10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素G、100 μg/mL鏈霉素、Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28、佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯、植物血凝素-L、RNeasy Mini Kit、Human IL-4 Quantikine HS ELISA試劑盒、Mouse IL-4 Quantikine ELISA試劑盒、CellTiter-Glo 2.0 Assay、TaqMan RNA-to-Ct 1-Step Kit、Taqman探針、10%中性緩沖福爾馬林。

儀器

96孔細胞培養(yǎng)板、數(shù)字測厚儀、ASCH VAPOSCAN 經(jīng)皮水分流失測量儀、QuantStudio 7 Flex實時熒光定量PCR系統(tǒng)、光學顯微鏡、組織包埋機、石蠟切片機。

ASCH VAPOSCAN 經(jīng)皮水分流失測量儀

實驗過程

本研究分為體外人PBMCs實驗、體內(nèi)DNFB誘導小鼠AD樣皮炎實驗，同時開展組織病理檢查與統(tǒng)計學分析，所有動物實驗均遵循ARRIVE指南及日本煙草公司制藥研究所動物實驗指南。

體外人PBMCs實驗

1. AhR通路激活與抗氧化基因表達檢測：將解凍后的人PBMCs接種于96孔板，加入CD3/CD28抗體刺激2天，隨后加入0.01、0.1、1 μmol/L的Tapinarof繼續(xù)培養(yǎng)1天；收集細胞并提取總RNA，通過RT-qPCR檢測CYP1A1和NQO1的mRNA表達水平。

2. Th2細胞活化抑制檢測：將人PBMCs以相同方式接種，加入PMA和PHA-L刺激，同時加入0.1、0.3、1、3、10 μmol/L的Tapinarof培養(yǎng)2天；收集細胞上清液，通過ELISA檢測IL-4含量，并用CellTiter-Glo 2.0 Assay檢測細胞活力。

體內(nèi)DNFB誘導小鼠AD樣皮炎實驗

1. 模型構(gòu)建與給藥：將適應飼養(yǎng)1周后的7周齡雌性BALB/c小鼠左側(cè)耳部雙側(cè)，用0.15% DNFB（丙酮/橄欖油3:1溶解）25 μL進行處理，每3-4天1次，共5次，持續(xù)15天；從DNFB處理當天開始，每日給小鼠左側(cè)耳部雙側(cè)外用20 μL的Tapinarof（0.01%、0.1%、1%）、FK506（0.1%）或乙醇載體，持續(xù)15天。

2. 指標檢測：在第1、2、8、9、15、16天用數(shù)字測厚儀檢測小鼠耳厚度，計算與基線的差值；第16天檢測耳厚度后，用ASCH VAPOSCAN 經(jīng)皮水分流失測量儀測皮膚TEWL；隨后處死小鼠，取左側(cè)耳部組織分為三部分，分別用于基因表達、細胞因子檢測和組織病理檢查。

第16天測量的耳部皮膚 TEWL

3. 基因與細胞因子檢測：將耳部組織勻漿后提取總RNA，通過RT-qPCR檢測Cyp1a1和Nqo1的mRNA表達；通過ELISA檢測耳部組織中的IL-4水平。

4. 組織病理檢查：將耳部組織用10%中性緩沖福爾馬林固定、石蠟包埋、HE染色，在光學顯微鏡下觀察真皮炎癥細胞浸潤、表皮角化過度、痂皮形成情況，并按既定標準進行病理分級。

統(tǒng)計分析

體外實驗采用Shirley-Williams檢驗比較載體組與Tapinarof組的差異，單側(cè)水平2.5%；體內(nèi)實驗先通過F檢驗/巴特利特檢驗進行方差齊性分析，方差齊時采用Student t檢驗/鄧尼特檢驗，方差不齊時采用Aspin-Welch t檢驗/Steel檢驗，雙側(cè)水平5%。

實驗結(jié)論

1. Tapinarof可在人PBMCs中激活AhR通路并抑制Th2細胞活化：在0.01 μmol/L及以上濃度時，Tapinarof可上調(diào)人PBMCs中CYP1A1和NQO1的mRNA表達，激活AhR通路與抗氧化活性；在0.1~10 μmol/L濃度范圍內(nèi)，Tapinarof可濃度依賴性抑制PMA/PHA-L刺激的人PBMCs產(chǎn)生IL-4，僅10 μmol/L時出現(xiàn)細胞活力明顯下降，證明其可有效抑制Th2細胞活化。

2. Tapinarof可抑制小鼠AD樣皮膚炎癥：DNFB誘導的小鼠出現(xiàn)明顯耳部腫脹，而0.01%及以上濃度的Tapinarof可抑制小鼠耳腫脹，效果與陽性藥FK506相當；同時Tapinarof可降低小鼠皮膚TEWL，改善表皮屏障功能。

3. Tapinarof可減輕AD樣皮炎小鼠的組織病理損傷：載體組小鼠真皮出現(xiàn)重度炎癥細胞浸潤，表皮存在輕至中度角化過度和痂皮形成，而Tapinarof可劑量依賴性降低炎癥細胞浸潤、角化過度和痂皮形成的發(fā)生率與嚴重程度。

4. Tapinarof可在小鼠皮膚中激活AhR通路并降低IL-4水平：0.01%及以上濃度的Tapinarof可上調(diào)小鼠耳部組織中Cyp1a1和Nqo1的mRNA表達，同時抑制DNFB誘導的IL-4水平升高，證明其通過激活AhR通路抑制Th2細胞因子產(chǎn)生，發(fā)揮抗炎作用。

5. Tapinarof的抗AD作用涉及多靶點藥理機制：Tapinarof不僅可通過激活AhR通路發(fā)揮抗氧化作用、改善皮膚屏障功能，還能抑制Th2型炎癥反應，其藥理特性與現(xiàn)有AD治療藥物不同，是具潛力的新型外用治療候選藥物，或?qū)ΜF(xiàn)有藥物無應答/應答不佳的AD患者有效。