2024年10月南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院整形外科的盧峰和何運凡研究團隊，在《Plastic and Reconstructive Surgery》期刊上發(fā)表了題為“Adipokine-Enriched Adipose Extract Restores Skin Barrier and Ameliorates Inflammatory Dysregulation in Atopic Dermatitis Mice"（富含脂肪因子的脂肪提取物修復特應性皮炎小鼠皮膚屏障并改善炎癥失調(diào)）的研究。聚焦于新型富含脂肪因子的產(chǎn)物——脂肪膠原片段（ACF），通過卵清蛋白誘導的特應性皮炎（AD）小鼠模型，探究其是否能通過調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境和修復皮膚屏障來緩解AD癥狀。

摘要

背景

特應性皮炎（AD）是一種發(fā)病率較高的慢性皮膚病，其特征為皮膚屏障異常和免疫失調(diào)。傳統(tǒng)療法通常受限于副作用和高成本。鑒于脂肪因子具有抗炎和修復特性，其日益被認為是治療皮膚病的潛在候選藥物。脂肪膠原片段（ACF）作為一種新型富含脂肪因子的產(chǎn)物，可能通過調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境和修復皮膚屏障來緩解AD。

方法

采用高速勻漿（10,000轉(zhuǎn)/分鐘，持續(xù)1分鐘）和離心（3000×g，持續(xù)3分鐘）的方法從脂肪組織中提取ACF。將卵清蛋白誘導的AD雌性BALB/c小鼠（6周齡）隨機分為兩組，分別皮內(nèi)注射0.2 mL ACF（ACF組）或磷酸鹽緩沖鹽水（PBS組，陰性對照），同時設(shè)置正常小鼠作為正常對照組（n=6）。在AD誘導期結(jié)束后（第50天），評估皮膚病嚴重程度、炎癥相關(guān)指標（表皮厚度、浸潤的肥大細胞數(shù)量、輔助性T細胞（Th）型細胞因子表達）以及皮膚屏障相關(guān)指標（經(jīng)表皮失水率、皮膚屏障相關(guān)蛋白表達）。此外，通過蛋白質(zhì)組學分析評估ACF中的生物活性成分。

結(jié)果

ACF來源的脂肪因子包含抗炎、皮膚屏障相關(guān)和脂質(zhì)生物合成相關(guān)成分。ACF治療可降低AD皮膚的皮膚病嚴重程度（6.2±1.8，P<0.0001）、表皮厚度（25.7±12.8μm，P=0.0045）、浸潤的肥大細胞數(shù)量（31.3±12.4個/視野，P=0.0475）以及Th型細胞因子（干擾素-γ、腫瘤壞死因子-α、白細胞介素（IL）-4、IL-4R、IL-13和IL-17A，P<0.05）的表達。同時，ACF治療還改善了經(jīng)表皮失水率（29.8±13.8g/m2·h，P=0.0306）和皮膚屏障相關(guān)蛋白的表達（絲聚蛋白：14,258±4375，P=0.0162；兜甲蛋白：6037±1728，P=0.0010；緊密連接蛋白-1：20,043±6406，P=0.0420；閉合小環(huán)蛋白-1：4494±1114，P=0.0134）。

結(jié)論

ACF通過改善炎癥失調(diào)和皮膚屏障缺陷，在小鼠模型中改善了AD癥狀。該療法需在更高級的動物模型中進一步驗證。

實驗材料與儀器

材料

1. 實驗動物：6周齡雌性BALB/c小鼠；

2. 主要試劑：卵清蛋白、磷酸鹽緩沖鹽水、Dulbecco改良 Eagle 培養(yǎng)基、TRIzol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、H&E染色試劑、TB染色試劑、4',6-二脒基-2-苯基吲哚；

3. 抗體：抗絲聚蛋白抗體、抗兜甲蛋白抗體、抗緊密連接蛋白-1抗體、抗閉合小環(huán)蛋白-1抗體、抗細胞角蛋白16（CK16）抗體及相應二抗；

儀器

高速勻漿機、離心機、ASCH VAPOSCAN經(jīng)皮水分流失測量儀、顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、Q-Exactive質(zhì)譜儀、Easy nLC液相色譜系統(tǒng)。

實驗過程

1. 實驗動物飼養(yǎng)

BALB/c小鼠飼養(yǎng)于25℃無病原體環(huán)境中，采用12小時光照/黑暗周期，自由進食飲水。

2. ACF制備

從每只BALB/c小鼠獲取約1.5g皮下脂肪組織，用PBS（pH7.4）洗滌兩次并切成小塊后，使用高速勻漿機以10,000轉(zhuǎn)/分鐘勻漿1分鐘，隨后依次通過0.25mm和0.15mm不銹鋼濾網(wǎng)去除大纖維片段。將過濾后的脂肪組織懸液以3000×g離心3分鐘，收集沉淀物即為ACF。

3. OVA誘導AD小鼠模型建立與分組處理

選取12只BALB/c小鼠，麻醉后脫毛，用3M Tegaderm膠帶對背部皮膚進行6次剝離處理，隨后將浸有100μg/100μL OVA/生理鹽水溶液的1×1cm無菌紗布敷于背部皮膚并固定，持續(xù)1周。每只小鼠進行三次1周的OVA致敏，間隔為兩周，整個模型制備周期為49天。在模型制備第28天，將致敏的AD小鼠隨機分為兩組（每組n=6）：ACF組背部皮膚致敏部位皮內(nèi)注射0.2mL ACF；PBS組注射0.2mL PBS作為陰性對照；另設(shè)6只未進行OVA致敏的小鼠作為正常對照組（NC組）。

4. 檢測指標與方法

• AD癥狀嚴重程度評估：第50天，對紅斑/出血、結(jié)痂/抓痕、滲液/糜爛、腫脹/水腫、干燥、苔蘚樣變6項癥狀進行評分，每項評分范圍為0（無）至3（嚴重），總分為癥狀嚴重程度評分。

• TEWL水平測量：在AD誘導前（第1天）和誘導后（第50天），于室溫濕度條件下，用ASCH VAPOSCAN經(jīng)皮水分流失測量儀測量小鼠背部皮膚TEWL水平。

ASCH  VAPOSCAN經(jīng)皮水分流失測量儀

（左）正常對照組（NC）、磷酸鹽緩沖液組（PBS）及 ACF 組小鼠背部皮膚的經(jīng)皮水分流失（TEWL）檢測結(jié)果（樣本量 n=6，均值 ± 標準差）。（右）采用 ImageJ 軟件對免疫組化（IHC）染色圖像進行定量分析，獲得的正常對照組（NC）、磷酸鹽緩沖液組（PBS）及 ACF 組皮膚樣本中絲聚蛋白、兜甲蛋白、閉合蛋白 1 及緊密連接蛋白 1的表達水平（樣本量 n=10，均值 ± 標準差）。P<0.05；P<0.001；****P<0.0001。統(tǒng)計方法采用單因素方差分析結(jié)合杜凱檢驗，同時采用**克魯斯卡爾 - 沃利斯檢驗。

• 組織學檢查：第50天將小鼠，取背部皮膚，一半固定于10%福爾馬林溶液中，石蠟包埋后切成4μm切片，進行H&E染色（評估表皮厚度）和TB染色（計數(shù)浸潤的肥大細胞），通過ImageJ軟件分析圖像。

• 定量實時聚合酶鏈反應（qPCR）：采用TRIzol試劑提取皮膚組織RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，以β-肌動蛋白為內(nèi)參基因，通過qPCR檢測Th1型細胞因子（IFN-γ、TNF-α）、Th2型細胞因子（IL-4、IL-4R、IL-13）和Th17型細胞因子（IL-17A）的相對基因表達水平。

• 免疫組化（IHC）與免疫熒光染色：對石蠟切片進行抗原修復后，加入相應一抗和二抗進行IHC染色，通過ImageJ軟件半定量分析絲聚蛋白、兜甲蛋白、緊密連接蛋白-1和閉合小環(huán)蛋白-1的表達；免疫熒光染色則將CK16抗體與皮膚屏障相關(guān)蛋白抗體共孵育，DAPI染核，通過激光共聚焦顯微鏡觀察蛋白共定位情況。

• ACF浸出液制備與蛋白質(zhì)組學分析：將0.3mL ACF置于3mL DMEM中，37℃、5%CO?、95%濕度條件下培養(yǎng)72小時，3000×g離心3分鐘收集上清液作為ACF浸出液。采用過濾輔助蛋白質(zhì)組制備酶解方法提取肽段，通過Q-Exactive質(zhì)譜儀結(jié)合Easy nLC進行質(zhì)譜分析，利用Proteome Discoverer 2.2軟件進行蛋白鑒定，Blast2GO軟件進行基因本體（GO）注釋分析。

5. 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)以均值±標準差（mean±SD）表示，采用Kruskal-Wallis檢驗或單因素方差分析（ANOVA）結(jié)合Tukey檢驗進行性分析，P<0.05視為差異具有統(tǒng)計學意義，使用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計處理。

實驗結(jié)論

1. ACF治療可緩解OVA誘導的AD小鼠模型的皮膚病癥狀，降低癥狀嚴重程度評分，其緩解效果優(yōu)于部分傳統(tǒng)療法及脂肪來源間充質(zhì)干細胞（ADSCs）療法。

2. ACF能有效減輕AD皮膚的表皮增厚和肥大細胞浸潤，使表皮厚度基本恢復至正常水平，減少炎癥細胞在皮膚組織中的聚集。

3. ACF可下調(diào)AD皮膚中Th1、Th2和Th17型炎癥細胞因子的表達，糾正炎癥失調(diào)，且抑制的細胞因子譜比ADSCs更廣泛。

4. ACF能改善AD皮膚的經(jīng)表皮失水率，上調(diào)絲聚蛋白、兜甲蛋白、緊密連接蛋白-1和閉合小環(huán)蛋白-1等皮膚屏障相關(guān)蛋白的表達，修復受損的皮膚屏障。

5. 蛋白質(zhì)組學分析證實，ACF含有823種脂肪因子，其中包括26種皮膚屏障相關(guān)、37種抗炎相關(guān)和41種脂質(zhì)生物合成相關(guān)脂肪因子，這些成分是ACF發(fā)揮治療作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。

6. ACF作為一種自體來源、制備快速簡便、無明顯嚴重副作用的注射用產(chǎn)物，有望成為解決AD的潛在方法，但需在更大樣本量的動物模型中進一步驗證，并確定治療劑量后再推進至臨床研究。