北海道健康科學(xué)大學(xué)牙口腔生物學(xué)系生理學(xué)分部的Takeharu Niioka團(tuán)隊(duì)的研究成果“Involvement of vasoactive intestinal polypeptide in the parasympathetic vasodilatation of the rat masseter muscle"發(fā)表于《Archives of Oral Biology》期刊。該研究聚焦大鼠咬肌，旨在探究三個(gè)問(wèn)題：（1）支配血管的副交感神經(jīng)是否具有血管活性腸多肽（VIP）免疫反應(yīng)性；（2）靜脈注射VIP是否會(huì)誘導(dǎo)咬肌血管舒張；（3）選擇性VIP受體拮抗劑[4Cl-D-Phe6, Leu1?]VIP在有無(wú)阿托品存在的情況下，對(duì)副交感神經(jīng)血管舒張的影響。

摘要

已知大鼠咬肌內(nèi)的血管受副交感神經(jīng)支配，其血管舒張通過(guò)膽堿能和非膽堿能兩種機(jī)制實(shí)現(xiàn)，但非膽堿能機(jī)制尚未明確。近年來(lái)，有充分證據(jù)表明血管活性腸多肽（VIP）參與了口面部（如下頜下腺和下唇）的副交感神經(jīng)血管舒張過(guò)程，然而關(guān)于其在大鼠咬肌中的作用卻知之甚少。本研究以大鼠咬肌為研究對(duì)象，開展了以下探究：（1）支配血管的副交感神經(jīng)是否具有VIP免疫反應(yīng)性；（2）靜脈注射VIP是否會(huì)誘導(dǎo)血管舒張；（3）選擇性VIP受體拮抗劑[4Cl-D-Phe6, Leu1?]VIP在有無(wú)阿托品存在時(shí)，對(duì)副交感神經(jīng)血管舒張的影響。研究發(fā)現(xiàn)，在副交感耳神經(jīng)節(jié)和血管周圍的神經(jīng)纖維這兩個(gè)部位均檢測(cè)到了VIP免疫反應(yīng)性；靜脈注射VIP可誘導(dǎo)咬肌血管舒張，且[4Cl-D-Phe6, Leu1?]VIP能減弱VIP注射引發(fā)的血管舒張效應(yīng)；單獨(dú)使用[4Cl-D-Phe6, Leu1?]VIP時(shí)，無(wú)法抑制副交感神經(jīng)血管舒張，但當(dāng)[4Cl-D-Phe6, Leu1?]VIP與阿托品聯(lián)合使用時(shí)，可降低副交感神經(jīng)血管舒張效應(yīng)。這些結(jié)果表明：（1）支配咬肌血管的節(jié)后副交感神經(jīng)中存在VIP；（2）靜脈注射VIP可誘導(dǎo)咬肌血管舒張；（3）當(dāng)毒蕈堿膽堿能受體被阿托品阻斷或乙酰膽堿（ACh）釋放受抑制時(shí)，VIP可能參與咬肌的副交感神經(jīng)血管舒張調(diào)節(jié)。

實(shí)驗(yàn)材料與儀器

（一）實(shí)驗(yàn)材料

1. 動(dòng)物：成年雄性Wistar大鼠（體重260-640g）

2. 試劑：熒光金、無(wú)菌生理鹽水、烏拉坦、泮庫(kù)溴銨、4%多聚甲醛、0.1M磷酸鈉緩沖液（pH7.4）、30%蔗糖、1%非免疫驢血清、0.3%曲拉通X-100、0.3%牛血清白蛋白、VIP抗體、囊泡乙酰膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)體抗體、Alexa-488標(biāo)記的驢抗兔IgG抗體、Alexa-568標(biāo)記的驢抗山羊IgG抗體、熒光素蓖麻凝集素I、VIP、選擇性VIP受體拮抗劑[4Cl-D-Phe6, Leu1?]VIP、阿托品

3. 其他：明膠包被玻片

（二）實(shí)驗(yàn)儀器

Hamilton微量注射器、冷凍切片機(jī)、熒光顯微鏡、共聚焦激光掃描顯微鏡、插管器械

、加熱墊、Omegawave FLO-C1激光多普勒血流儀

實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1.動(dòng)物飼養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)大鼠采用12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗的飼養(yǎng)周期，自由攝食飲水。

2.熒光雙標(biāo)記法：熒光金逆行運(yùn)輸結(jié)合VIP或VAChT免疫組化

1. 大鼠經(jīng)腹腔注射50mg/kg）麻醉后，在頰部皮膚做小切口暴露咬肌表面，用Hamilton微量注射器向咬肌內(nèi)垂直注射1μL 2%熒光金，注射速度0.1ml/min，注射后留針2分鐘以防回流。

2. 48-72小時(shí)后，用度麻醉大鼠，先以250ml生理鹽水灌注，再用500ml 4%多聚甲醛灌注。

3. 取出耳神經(jīng)節(jié)（OG），浸泡于含30%蔗糖的冰冷緩沖液中，用冷凍切片機(jī)將其切成40μm切片，對(duì)所有切片進(jìn)行VIP和VAChT免疫組化染色。

4. 染色后將切片置于明膠包被玻片上，用熒光顯微鏡觀察FG標(biāo)記神經(jīng)元、VIP及VAChT免疫反應(yīng)性，計(jì)數(shù)每個(gè)耳神經(jīng)節(jié)切片中同時(shí)被FG與VIP或VAChT抗體標(biāo)記的神經(jīng)元胞體數(shù)量，并計(jì)算其占FG標(biāo)記神經(jīng)元總數(shù)的百分比（每個(gè)耳神經(jīng)節(jié)組織制備6-9個(gè)切片）。

3.VIP和VAChT的免疫組化染色

1. 取出耳神經(jīng)節(jié)和咬肌，浸泡于含30%蔗糖的冰冷緩沖液中，將兩者切成100μm切片，用磷酸鹽緩沖鹽水沖洗后，在含1%非免疫驢血清、0.3%曲拉通X-100和0.3%牛血清白蛋白的封閉液中孵育至少3小時(shí)。

2. 將切片置于含VIP抗體和VAChT抗體的封閉液中，4℃孵育2天；經(jīng)磷酸鹽緩沖鹽水沖洗后，再置于含Alexa-488標(biāo)記的驢抗兔IgG抗體和/或Alexa-568標(biāo)記的驢抗山羊IgG抗體的封閉液中，4℃孵育1天。

3. 部分咬肌切片僅用VIP抗體和Alexa-568標(biāo)記的驢抗兔IgG抗體進(jìn)行免疫組化染色，染色后在4℃下與20mg/ml熒光素蓖麻凝集素I（RCA-I）孵育30分鐘（RCA-I為嚙齒動(dòng)物血管壁標(biāo)志物）。

4. 沖洗后將切片置于明膠包被玻片上，用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察熒光；對(duì)照組實(shí)驗(yàn)通過(guò)在孵育液中省略一抗或二抗進(jìn)行。

4.咬肌血流量（MBF）測(cè)量

1. 大鼠經(jīng)吸入誘導(dǎo)麻醉后，腹腔注射烏拉坦維持麻醉，對(duì)股靜脈和股動(dòng)脈進(jìn)行插管，分別用于藥物注射和監(jiān)測(cè)全身動(dòng)脈血壓（SABP）。

2. 對(duì)大鼠進(jìn)行氣管插管，靜脈注射泮庫(kù)溴銨（初始劑量0.6mg/kg，之后每小時(shí)左右補(bǔ)充0.4mg/kg）使其麻痹，通過(guò)氣管插管給予50%空氣-50%氧氣混合氣體人工通氣，用加熱墊維持直腸溫度在37℃。

3. 實(shí)驗(yàn)前切斷頸部雙側(cè)頸迷走神經(jīng)和雙側(cè)頸上交感干，以排除迷走神經(jīng)對(duì)心血管系統(tǒng)的反射作用及交感縮血管纖維對(duì)口面部的影響。

電刺激左側(cè)舌神經(jīng)（LN）的中樞切斷端以誘發(fā)咬肌副交感神經(jīng)反射性血管舒張，使用Omegawave FLO-C1激光多普勒血流儀監(jiān)測(cè)監(jiān)測(cè)并記錄咬肌血流量變化，通過(guò)血流儀圖表上的反應(yīng)高度量化血流量變化（結(jié)果以任意單位表示）。

Omegawave FLO-C1激光多普勒血流儀

(A) 舌神經(jīng)電刺激（對(duì)照組）以及靜脈注射不同劑量血管活性腸肽（VIP，1、10、100 ng/kg）后，局部血流量（MBF）升高的典型示例。

(B) 靜脈注射 0（僅生理鹽水）、1、10、100 ng/kg VIP 后，局部血流量（MBF）升高幅度的匯總統(tǒng)計(jì)（n = 4）。數(shù)據(jù)以舌神經(jīng)電刺激（對(duì)照組）誘發(fā)反應(yīng)的百分比表示。

(C) 在選擇性血管活性腸肽受體拮抗劑（[4 - 氯 - D - 苯丙氨酸?, 亮氨酸 1?] - 血管活性腸肽）存在及缺失情況下，注射 100 ng/kg VIP 誘發(fā)局部血流量（MBF）升高的典型示例。

(D) [4 - 氯 - D - 苯丙氨酸?, 亮氨酸 1?] - 血管活性腸肽對(duì) 100 ng/kg VIP 誘發(fā)局部血流量（MBF）升高效應(yīng)的影響，以用藥前反應(yīng)的百分比表示（n = 5）。

5. 分別以0（僅生理鹽水）、1、10、100ng/kg劑量的VIP（溶于生理鹽水）經(jīng)導(dǎo)管注射，觀察咬肌血流量變化；在注射VIP前20分鐘，持續(xù)注射0.1mg/ml的[4Cl-D-Phe6, Leu1?]VIP（注射速度2ml/min），觀察其對(duì)VIP誘導(dǎo)的咬肌血流量變化的影響。

6. 分別在靜脈注射阿托品（0.1mg/kg）后、持續(xù)輸注[4Cl-D-Phe6, Leu1?]VIP時(shí)、同時(shí)使用兩種藥物時(shí)，電刺激舌神經(jīng)，將各處理后的數(shù)據(jù)以處理前（對(duì)照）反應(yīng)的百分比表示。

5.統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）結(jié)合雙側(cè)Dunnett檢驗(yàn)或Tukey校正評(píng)估測(cè)試反應(yīng)變化的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，P<0.05視為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件（Windows系統(tǒng)）進(jìn)行分析。

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

1. 支配大鼠咬肌血管的節(jié)后副交感神經(jīng)中存在VIP免疫反應(yīng)性，且VIP與囊泡乙酰膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)體（VAChT，膽堿能標(biāo)志物）在耳神經(jīng)節(jié)的FG標(biāo)記神經(jīng)元胞體及咬肌血管周圍的神經(jīng)纖維上共定位。

2. 靜脈注射VIP可以劑量依賴方式誘導(dǎo)大鼠咬肌血管舒張，且不影響全身動(dòng)脈血壓；選擇性VIP受體拮抗劑[4Cl-D-Phe6, Leu1?]VIP能抑制VIP誘導(dǎo)的咬肌血管舒張，表明VIP可能通過(guò)激活咬肌血管壁上的VIP受體發(fā)揮血管舒張作用。

3. 單獨(dú)使用[4Cl-D-Phe6, Leu1?]VIP無(wú)法抑制舌神經(jīng)電刺激誘發(fā)的咬肌副交感神經(jīng)血管舒張；單獨(dú)使用阿托品可使該血管舒張效應(yīng)降低約36%；而當(dāng)[4Cl-D-Phe6, Leu1?]VIP與阿托品聯(lián)合使用時(shí)，血管舒張效應(yīng)降低約66%。這表明當(dāng)毒蕈堿膽堿能受體被阿托品阻斷或乙酰膽堿（ACh）釋放受抑制時(shí)，VIP可能參與咬肌的副交感神經(jīng)血管舒張調(diào)節(jié)。