，Ni SEPHAROSE 6 Fast Flow, 5 mL，IMAC層析填料

Ni Sepharose 6 Fast Flow是一種高結(jié)合量的IMAC層析填料，用于純化標(biāo)簽的蛋白質(zhì)。在各種規(guī)模中用于純化的良好選擇。

    產(chǎn)品特點(diǎn)

    這是一款規(guī)的填料，有著高載量，良好的兼容性、流速快、易放大等特點(diǎn)，是標(biāo)簽手動(dòng)純化的常規(guī)選擇，是一款經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的入門(mén)基本款

    常見(jiàn)問(wèn)題

    純化所得組分中為何沒(méi)有重組的His標(biāo)簽蛋白？

    一方面  若His標(biāo)簽蛋白沒(méi)有結(jié)合到填料上就流穿了

    原因1 超聲的功率不對(duì)

    超聲功率過(guò)高，容易導(dǎo)致蛋白炭化；功率過(guò)低，蛋白釋放不出來(lái)。

    建議：改變超聲功率，同時(shí)可以在超聲前加入。

    原因2 結(jié)合緩沖液條件不合適

    建議：檢查結(jié)合緩沖液中是否有影響結(jié)合的因素，如：金屬離子螯合劑、強(qiáng)還原劑、過(guò)高的咪唑濃度。pH的改變也會(huì)對(duì)結(jié)合效果有影響，可以摸索不同的pH條件，可能會(huì)收到意想不到的效果。

    原因3 His標(biāo)簽沒(méi)有表達(dá)或丟失或暴露不充分

    建議1：用anti-His的抗體進(jìn)行WB，檢測(cè)His標(biāo)簽是否存在。

    建議2：將蛋白用4-6M鹽酸胍或4-8M尿素變性后，讓His標(biāo)簽充分暴露出來(lái)，看是否能與填料結(jié)合。

    建議3：改變His標(biāo)簽的位置或者增加其數(shù)目（常用6-10個(gè)His），增加暴露和結(jié)合機(jī)會(huì)。

    建議4：改變金屬結(jié)合離子，除了Ni2+，Cu2+、Zn2+、Co2+也可以用來(lái)進(jìn)行His標(biāo)簽的捕獲。

    另一方面  若His標(biāo)簽蛋白結(jié)合了，但是洗脫不充分

    原因1 洗脫條件太溫和

    建議：增加咪唑的濃度或選擇咪唑線(xiàn)性梯度洗脫，或者通過(guò)降低pH尋找洗脫條件。需要注意的是，pH低于3.5容易導(dǎo)致鎳離子脫落。

    原因2 蛋白柱上沉淀

    建議1：降低蛋白濃度?？梢詼p少上樣量，或者采用咪唑線(xiàn)性而非步級(jí)梯度洗脫，增加蛋白稀釋度。

    建議2：使用去污劑或者改變NaCl的濃度，或者使用變性劑（4-6M鹽酸胍或4-8M尿素）在變性條件下洗脫。

    原因3 非特異性的疏水或者其他相互作用

    建議：加入非離子型去污劑到洗脫緩沖液（如：2% Triton X-100）或增加NaCl的濃度洗脫。