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Western Blot結(jié)果條帶全面分析

發(fā)布時間：2023-1-21

在黑暗的發(fā)光室中慢慢等待，只為最后膠片上看的你！

1. 啥也沒有

原因：比較多，如果單純一張沒有任何顯色的X光片，最可能是一抗加成其他抗體，或者二抗種屬加錯了，比如兔的加成鼠的。

解決辦法：仔細(xì)檢查抗體是否加錯，確認(rèn)轉(zhuǎn)膜沒有問題。

經(jīng)驗(yàn)：上面的圖片展示的是一點(diǎn)信號都沒有，如果是這樣大部分情況是抗體加錯了。如果中間出現(xiàn)了細(xì)微的條帶，可能原因是蛋白上樣量太少，一抗?jié)舛冗^低，ECL發(fā)光液失效。另外如果轉(zhuǎn)膜出現(xiàn)了問題，比如膜放反了，自然是一個白片。

2. 高背景

原因：封閉不夠好，一抗?jié)舛雀?，洗膜時間和次數(shù)不夠

解決辦法：降低一抗?jié)舛?，增加洗膜時間和次數(shù)。

經(jīng)驗(yàn)：高背景可能是WB中見出現(xiàn)的問題，目的條帶單一清晰，但是其他地方又彌漫性較為均一的背景（比較連續(xù)的）。其實(shí)只要我們注意操作規(guī)范，不偷工減料就很容易避免，洗膜按照規(guī)定來5min*5次或者10min*3次，不要改成5min*3次，或者10min*2次。

3. 非特異性條帶

原因：一抗非特異性與蛋白結(jié)合

解決辦法：更換一抗

經(jīng)驗(yàn)：此種情況絕大多數(shù)是因?yàn)橐豢共缓?，你無法判斷那一條是目的條帶。如果實(shí)在沒有更好的抗體，建議采用陰性對照和陽性對照來確定上述哪個條帶是目的條帶。當(dāng)然這種情況下有一種很小幾率的可能是一抗?jié)舛忍咭鸬姆翘禺愋越Y(jié)合。

4. 條帶中出現(xiàn)邊緣規(guī)則的白圈

原因：電轉(zhuǎn)中膜和膠之間存在氣泡。

解決辦法：轉(zhuǎn)膜前去掉膜和膠之間的氣泡

經(jīng)驗(yàn)：我們常常將電轉(zhuǎn)液倒入一個盤子里，倒入的液體不能太多也不能太少，高度是與放上層濾紙齊平，然后往濾紙上澆點(diǎn)轉(zhuǎn)膜液，把電泳膠用清水清洗下，將電泳膠平鋪到濾紙上，仔細(xì)檢查濾紙與膠之間是否有氣泡，可以左右前后觀察，不同方向觀察之后確認(rèn)無氣泡，然后再往膠上面澆點(diǎn)電轉(zhuǎn)液，用兩只手的拇指和食指輕輕夾住PVDF膜的兩側(cè)中間，使膜成U型，然后將U型的底部接觸膠的中間，慢慢往兩邊放下膜，這樣一般氣泡很少。然后上層濾紙同樣用U型的放置方法，用玻璃棒稍微貼實(shí)下，然后蓋上海綿。注意不要來回趕氣泡，這樣反而會帶入氣泡。

5. 條帶中間出現(xiàn)白色（反白）

原因：中心部位高濃度HRP把底物消耗過快，中間部位底物消耗結(jié)束之后就不發(fā)光了

解決辦法：降低蛋白量，降低一抗和二抗的濃度。

經(jīng)驗(yàn)：如果你足夠迅速，可以在中間部位底物消耗之前就把X光片給定影出來，但是時間很難把握，建議還是從降低蛋白量，降低一抗二抗?jié)舛热胧帧?/span>

6. 出現(xiàn)黑點(diǎn)和黑斑

原因：膜上其他部位與一抗或者二抗非特異性結(jié)合

解決辦法：封閉牛奶一定要純，封閉結(jié)束之后要洗

經(jīng)驗(yàn)：我們常常是等到要封閉的時候發(fā)現(xiàn)沒有牛奶，然后匆匆忙忙用PBST/TBST配置，配的匆忙的時候往往不管是否已經(jīng)溶解，如果沒有溶解的情況下加牛奶倒膜上，會導(dǎo)致很多不溶性顆粒附著在膜上，這就會導(dǎo)致發(fā)光時候膜上的黑點(diǎn)。所以牛奶溶解之后，靜止一下，然后輕輕地吸取上層牛奶進(jìn)行封閉，封閉結(jié)束之后一定要洗三遍之后再加一抗。

7. 條帶拖尾

原因：蛋白量太大，一抗?jié)舛群蜁r間太長

解決辦法：根據(jù)情況調(diào)整蛋白量，同時一抗?jié)舛群蜁r間也可以縮短。

經(jīng)驗(yàn)：這種情況很容易出現(xiàn)，因?yàn)楹芏嘣蚨伎赡軐?dǎo)致這一個結(jié)果。一般來說，蛋白量都是我們經(jīng)過很多次摸索得出的蛋白量，因此不太可能是蛋白量過多引起的?？赡艿氖且?yàn)橐豢節(jié)舛忍撸饔脮r間太長引起的。另外洗一抗和洗二抗千萬不要偷工減漏，建議5min*5次，不要但是洗這么多次就把抗體和蛋白洗掉了，你又不是拿刀在上面刮，真正的抗原抗體的結(jié)合是通過這種方式洗不掉的。

8. 出現(xiàn)重影

原因：熒光強(qiáng)度比較高，在壓片時，放好之后不小心又輕微移動了一段距離

解決辦法：X光片放上去之后，就不要動了，即使放歪了也沒關(guān)系。

經(jīng)驗(yàn)：有的時候出現(xiàn)重新剛好在上下位置，并且重影會相對弱一些，不要誤以為抗體識別了該蛋白的另外一種異構(gòu)形式。

9. 出現(xiàn)非均一性背景

原因：膜可能曾經(jīng)干過

解決辦法：在每一步的操作過程中，都需要注意不要讓膜干

經(jīng)驗(yàn)：在封閉的時候，洗一抗，洗二抗，以及發(fā)光的時候都時刻需要注意蛋白面不要風(fēng)干，風(fēng)干之后結(jié)果很可能就是這個樣子。注意與高背景區(qū)別。

10. 某個條帶變形

原因：SDSPAGE膠中存在氣泡或者某不溶性顆粒

解決辦法：配膠過程中要小心，使用無雜質(zhì)的液體。

經(jīng)驗(yàn)：很多實(shí)驗(yàn)室中使用的不是的設(shè)備，比如配膠用的海綿墊，如果用了很多年之后，會從下面往上面漏小氣泡，當(dāng)氣泡足夠小并且膠快凝固的時候，走到中間的小氣泡就停留在膠內(nèi)，并會影響到后面的跑膠。另外配膠用的水，SDS，Tris緩沖液要注意不要有雜質(zhì)。

11. 條帶呈啞鈴狀

原因：配置膠有問題

解決辦法：把膠配好，不合格的膠堅(jiān)決不用

經(jīng)驗(yàn)：出現(xiàn)啞鈴的可能是膠沒有配置好，膠凝固后不均一，不知道大家有沒有出現(xiàn)如下的配膠情況，下圖中示意拔完梳子之后的結(jié)果，如果你拔完梳子之后出現(xiàn)圖中下面部分的樣子，多半會出現(xiàn)啞鈴狀。另外還有一種可能是樣品中含有太多雜質(zhì)，沒有離心下來，然后雜質(zhì)沉積在孔的中間，蛋白自然被推擠到兩邊。