前言
日前的央視要聞報道中，樂純生物LePhinix®? 一次性生物反應器作為上海重要科技創(chuàng)新成果出鏡。事實證明，從上游工藝、耗材環(huán)節(jié)創(chuàng)新突破，是賦能甚至反推中國生物制藥產業(yè)鏈全鏈條“做大做強”的必要條件。本次引發(fā)高層領導和媒體關注的一次性生物反應器，是樂純生物于2022年推出的自研產品。一次性生物反應器是典型的卡脖子產品。從所應用到的生物工藝film薄膜到數字化控制系統(tǒng)，全部都有其技術難點。樂純生物LePhinix®? 一次性生物反應器背后有扎實*的研發(fā)支撐，在不斷推出新產品的同時，也形成了豐富的理論成果，定期在行業(yè)內開源分享。
借本次機會，將該項目應用技術負責人孫煥博士一篇技術干貨文分享給大家，看樂純生物如何攻克2000L一次生物反應器的放大要點及難點。
純技術干貨，建議深閱讀——
生物工藝在逐級放大過程中，為保證細胞在相對恒定的環(huán)境中可實現穩(wěn)定的增殖和表達，通常在不同的規(guī)模下會采用相對變化的培養(yǎng)方式，在生物反應器中實現最終的線性放大。
在前期進行細胞株開發(fā)時，多采用簡單的搖管或搖瓶篩選單克隆和培養(yǎng)基，并進行簡單的工藝策略摸索。
為能更好的摸索關鍵的工藝控制參數，如pH、DO、pCO2水平、連續(xù)補料的方式和速率等，后期的工藝開發(fā)越來越多采用智能化小型生物反應器來進行工藝控制，以達到更好的培養(yǎng)效果，并方便依據鎖定工藝后的控制條件進行后期的工藝放大。
研發(fā)階段使用的罐體一般多種多樣，罐體的高徑比、槳葉形狀、槳葉直徑、攪拌形式、通氣方式和通氣孔徑，與放大后使用的罐體很難達到完全一致?？紤]到操作便利性和廠房高度等因素，多數供應商不同體積罐體并不能實現等比例尺寸的放大，這就為后面的放大造成了一定的挑戰(zhàn)。
一般來說，放大主要從兩個維度來綜合考量，一方面是體積相關工藝參數的放大，如攪拌速度、通氣量等相關工藝條件，需要綜合反應器的高徑比、槳葉直徑、P/V、混合時間、KLa等進行攪拌速率的換算，并通過表觀通氣速率和單位體積氣體流速擬定通氣量；另外一方面是非體積相關工藝參數的放大，包括補料速率、pCO2水平控制、通氣方式、通氣孔徑的選擇等，需要結合pH和DO的控制和細胞的耐剪切力水平，采用經驗放大的方式來進行。
樂純生物LePhinix®? 2000L一次性生物反應器CFD圖
a. LePhinix® 2000L 速度矢量圖(70rpm )
b. LePhinix® 2000L 湍流強度圖(70rpm)
c&d. LePhinix® 2000L 剪切強度分布圖
對于終端應用客戶而言，細胞培養(yǎng)過程中的工藝放大多從以下幾個方面來考量：
恒定體積功率P/V
使用恒定的單位體積功率輸入(P/V)是哺乳動物細胞放大培養(yǎng)中常用的放大方法之一。反應器的功率輸入(P)與槳葉的直徑(Di)和攪拌的轉速(N)成正向關系，槳葉的直徑越大，轉速越高，反應器的功率輸入就越大。
不同的反應器，相同槳葉直徑和轉速的情況下，由于槳葉形狀、角度、位置和尺寸大小的不同以及罐體的差異，功率常數(Np)不同，功率輸入也會有所變化。
單位體積的功率輸入：P/V=NpN3Di5ρ/V
其中：
• P —— 槳葉的功率輸入
• V —— 液體體積
• Np—— 功率常數
• N —— 槳葉轉速
• Di —— 槳葉直徑
• ρ —— 液體密度
在從小罐逐級放大到大規(guī)模體積培養(yǎng)的過程中，我們多遵循P/V值相對恒定的方式進行放大，在等P/V值的情況下，根據不同規(guī)模罐體槳葉直徑的變化，換算出轉速的差異。在對CHO細胞進行放大培養(yǎng)中，我們常用的P/V范圍一般會在10~30W/m3。同時，實際的操作過程中，也多參考供應商或者歷史數據的轉速范圍進行轉速的微調。
恒定體積氣體流速vvm
在細胞放大培養(yǎng)的過程中，第二個重點關注的放大點，即是氣體流速。
一般來說，一次性生物反應器會給予一個恒定的底部通氣和一個恒定的表層通氣，起始通氣速率一般為0.005vvm-0.01vvm，即50L體積的通氣量為0.25L-0.5L，200L的通氣量為1L-2L，2000L的通氣量為10L-20L。根據工藝的不同，一般空氣多通過大泡進行恒定速率的通氣，氧氣的通氣量根據細胞的氧氣消耗速率通過DO進行調控；當消耗量比較大時，可采用微泡通氣的方式提高氣液傳質效率。
氧氣傳質系數KLa
KLa的評估多在選擇反應器之初進行，這對于中試和商業(yè)化規(guī)模應用至關重要。KLa反應的是氣體的傳質速率，是反應器的槳葉設計、通氣孔徑大小、混合時間和氣體混合效率等的一個綜合評估指標，評估的是反應器的整體設計性能。
對于實驗室規(guī)模的生物反應器，由于體積比較有限，通常更容易達到必要的氧傳輸速率。通常，根據實驗室規(guī)模系統(tǒng)中的培養(yǎng)結果，按照同等氣體傳質效率的原則，參照選擇中試和商業(yè)規(guī)模的生物反應器。
混合時間
混合時間在實際的放大過程中多做為參考。實驗室規(guī)模的小體積反應器混合時間非常短，隨著規(guī)模變大，需要更高的攪拌速率來達到同樣的混合時間，或者在最大限速下無法達到小體積的混合時間。而且，更高的攪拌速率，會帶來更高的剪切應力，特別對于高敏感細胞株，會帶來不可逆的細胞損傷。因此，規(guī)模變放大過程中會關注混合時間，但是并不會做為主要的放大依據。
CO2去除
規(guī)模放大的過程中，常遇到的一個問題是CO2的蓄積，且規(guī)模越大，蓄積效應越加明顯。高濃度的CO2 往往會抑制細胞的生長代謝，甚至造成細胞毒性效應，因此規(guī)模放大過程中常采用加大底部通氣量的方式來驅除CO2，并且采用高效的大泡通氣的方式。在較大規(guī)模，如采用1000L以上規(guī)模培養(yǎng)時，常規(guī)的提高底部通氣的方式進一步受到限制，因此設計上會采用單獨一路更大孔徑通氣孔進行通氣，以達到有效消除CO2蓄積的目的。
樂純生物細胞培養(yǎng)線性放大的王牌組合
樂純生物開發(fā)的LePhinix®?一次性生物反應器涵蓋了50L至2000L，便利的上開門設計，左右兩側人性化的管路梳理裝置，頂部加入底部通氣濾器夾子，底部搭配水夾套設計，有效的滿足工藝應用的需求。適配的LeKrius®?一次性生物反應袋，頂部補料管路可根據反應器高度適度加長方便焊接，底部通氣管路加入防液體倒流裝置有效降低操作失誤。
左：LePhinix®? 一次性生物反應器全系列
右：LeKrius®?一次性生物反應袋
同時，樂純生物*的售前和售后支持團隊，可根據客戶要求進行一次性反應袋的定制化設計和配置。
LePhinix®? 一次性生物反應器規(guī)格
放大過程中的關鍵工藝控制點
生物反應器放大過程中，除了最為關鍵的攪拌轉速和通氣速率等因素外，還應通盤考慮整個工藝過程中的多重控制點，如培養(yǎng)基的過濾和收獲后的深層過濾，不同體積下補料的添加速率，體積變化導致的CO2控制策略變化，放大中的工藝參數偏移帶來的關鍵工藝指征有所轉變等等。濾器一般都可以直接通過線性放大的方式進行簡單放大，只是規(guī)模進一步放大過程中，操作時間的控制也需要綜合考慮進去。如溶液配制過程中，為了控制生物負載，需要控制配液的總時長。如細胞收獲步驟，為了提高收獲效率和保證蛋白質量，需要反應器進行降溫操作，并通過高通量和高流速實現控制收獲的總時間。
大體積培養(yǎng)基的配制過程，往往會出現小體積配制過程中意想不到的問題，如pCO2的控制失誤可能導致pH出現偏差，大量粉末的大批量加入帶來的粉塵問題，攪拌速度限制導致的粉末不能及時有效混合等等，因此在大體積的配制過程中選用的設施設備包括耗材等應充分考慮這這些因素，如增加攪拌時間，使用投料袋、控制溶液的配制時長等等。另外，大體積的溶液儲存方式也會發(fā)生變化，加上配制時間的增長，這要求我們需要綜合考慮溶液的配制時間和儲存時間，進行合理的規(guī)劃。
除此之外，通氣的增加帶來的大體積培養(yǎng)過程中有效通氣速率和氣體儲量也是我們需要進行考量的；放大過程中的控制水平偏移可能導致的工藝觸發(fā)條件發(fā)生變化，如觸發(fā)降溫的時間將會發(fā)生變化，這就需要工藝轉移過程中除了關注降溫的時間，還應該加入細胞密度這個最為關鍵的因素，以達到更加合理化控制的目的。
下周為大家具體解析樂純生物2000L 細胞培養(yǎng)放大的最新案例，敬請期待！
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