制藥網(wǎng)公司動態(tài)
【應(yīng)用筆記】-使用切口平移DNA標(biāo)記系統(tǒng)2.0評估濕度對FISH反應(yīng)
發(fā)布時(shí)間：2022-11-17引言
普遍認(rèn)為熒光染料dUTPs標(biāo)記DNA優(yōu)于間接兩步標(biāo)記法。結(jié)合切口平移DNA標(biāo)記系統(tǒng)2.0，熒光dUTPs的使用為FISH應(yīng)用熒光標(biāo)簽提供了一種簡單而有效的方法。
切口平移DNA標(biāo)記系統(tǒng)2.0適用于多種熒光標(biāo)記、標(biāo)記和標(biāo)記核苷酸，是包括熒光原位雜交(FISH)在內(nèi)的應(yīng)用中標(biāo)記大于1kb的雙鏈DNA的推薦方法。FISH是一種記錄良好的技術(shù)，可以用來標(biāo)記染色體中的DNA序列，用于科學(xué)研究和臨床應(yīng)用。
適當(dāng)?shù)臒晒庠浑s交需要相對濕潤的環(huán)境條件;然而，目前FISH反應(yīng)的濕度還未可知。本研究的主要目的是利用Boekel Scientific RapidFISH Slide原位雜交箱演示切口平移DNA標(biāo)記系統(tǒng)2.0在不同濕度條件下對FISH反應(yīng)的影響。
實(shí)驗(yàn)材料/器材
1.切口平移DNA標(biāo)記系統(tǒng)2.0 (Enzo Life Sciences, ENZ-GEN111)
2.綠色496 dUTP (Enzo Life Sciences，ez -42831)
3.原癌基因的Bacmid DNA
4.Nanodrop ND-1000 (Thermo Fisher)
5.QIAquick®PCR純化試劑盒(Qiagen, 28104, 28106)
6.Cot-1 DNA (Thermo Fisher, )
7.VECTASHIELD®防褪色封固劑含DAPI(Vector Laboratories，H-1200)
8.RapidFISH Slide原位雜交箱(Boekel Scientific, 240200)
9.CGH Metaphase Target Slides(Abbot Molecular, 06J96-001)
10.熒光顯微鏡(Olympus, BX51)
11.溫濕度數(shù)據(jù)記錄儀(Madgetech, RHTemp101A)
通過切口平移進(jìn)行熒光標(biāo)記DNA按如下表1、2所示步驟用綠色496 dUTP標(biāo)記。盡量降低移液誤差的影響,熟練混合3ug bacmid DNA,試劑在切口平移DNA標(biāo)記系統(tǒng)2.0試劑盒中,和5.2μL綠色496熒光標(biāo)記dUTP(濃度為0.3mM)。
純化
標(biāo)記為bacmid DNA的熒光染料必須在雜交前進(jìn)行純化。DNA探針采用QIAquick®PCR純化試劑盒進(jìn)行純化。樣本加入275µL PB Buffer輕輕混合(試劑盒),放置管中，室溫16100 x g離心1分鐘。棄掉上清，加入750μLPE Buffer(試劑盒)復(fù)溶后再次離心。加入10μL EB Buffer(試劑盒)將DNA洗脫,持續(xù)混勻一分鐘,隨后再16100 x g離心一分鐘。
測定DNA熒光染料攝入率
用Thermo Fisher Nanodrop®ND-1000 UV-VIS分光光度計(jì)在微陣列測量模式下測定每個(gè)制備批次中綠色496 dUTP的攝入率。
雜交和觀測
用雅培(產(chǎn)品，貨號 06J96-001)將人類男性分裂中期切片加熱到室溫,準(zhǔn)備雜交。每個(gè)樣本均添加純化后的綠色496標(biāo)記的探針和3μg(1μg /μL) Cot-1 DNA。每個(gè)原位雜交箱的托盤中添加不同量的無核酸酶水。將所有樣品分別放入Boekel RapidFISH Slide雜交箱中，37℃孵育過夜。
雜交箱內(nèi)無核酸酶水分別在0 mL、5 mL、10 mL、15 mL、20 mL、25 mL、30 mL進(jìn)行檢測。采用溫濕度數(shù)據(jù)記錄儀(Madgetech)對30秒采樣率下的工作溫度和相對濕度進(jìn)行測量。孵化后,每個(gè)樣品都仔細(xì)清洗和染色使用8μL VECTASHIELD®h - 1200防褪色封固劑含DAPI(1.5μg /毫升)處理，保證樣本不變色。
雜交后的樣品在雜交沖洗后用奧林巴斯BX51熒光顯微鏡和60X物鏡立即掃描。所有圖像均采用1秒曝光，同時(shí)使用DAPI和FITC熒光濾光片，以地評估濕度對FISH雜交的影響，同時(shí)盡量減少光褪色。
小結(jié)
利用切口平移DNA標(biāo)記系統(tǒng)2.0將綠色496熒光dUTP充分整合到bacmid DNA中。使用Boekel Scientific RapidFISH Slide雜交箱進(jìn)行FISH雜交，只需添加5 mL水分即可獲得明亮的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。當(dāng)水分含量超過20mL時(shí)，反應(yīng)效果不再變化。
Figure 1. 綠色496 dUTP探針(44.245 ng /μL)標(biāo)記人類染色體8在37°C 25毫升nuclease-free水條件下進(jìn)行FISH雜交后的成像效果?？梢暬笆褂盟{(lán)色DAPI復(fù)染劑復(fù)染。
注意綠色熒光的清晰度和強(qiáng)度。
熒光原位雜交(FISH)條件: 25 mL of 水分, 44.25 ng/µL of 探針
Figure 2. 在雜交過程中，使用Madgetech RHTemp101A數(shù)據(jù)記錄儀以30秒的采樣速率連續(xù)采集溫度和相對濕度條件。Boekel RapidFISH雜交箱具有升溫快、雜交過程溫度穩(wěn)定的特點(diǎn)。
雜交孵育的濕度條件
Figure 3. 培養(yǎng)過程中收集0- 30ml的相對濕度，采樣速率為30 s。每次增加水分(5 mL-30 mL)，平行兩組實(shí)驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)。相對濕度較低的紅線，沒有增加水分，表明雜交條件較差。
結(jié)論
我們進(jìn)行兩組對不同濕度下的使用綠色496熒光標(biāo)記bacmid DNA探針的FISH雜交實(shí)驗(yàn)，以確定條件，為FISH實(shí)驗(yàn)提供樣例。Boekel RapidFISH原位雜交箱與切口平移DNA標(biāo)記系統(tǒng)2.0一起被證明是快速、可預(yù)測和結(jié)果可重復(fù)的值得信賴的平臺。Boekel RapidFISH載玻片雜交箱憑借*的自鎖托盤機(jī)構(gòu)，在所有實(shí)驗(yàn)過程中，只要在載玻片雜交托盤中添加水分，該原位雜交箱始終保持恒溫和濕度條件。只有當(dāng)雜交托盤中不添加水分時(shí)，反映環(huán)境的相對濕度較低，且在孵育過程中波動較大。當(dāng)使用Boekel RapidFISH Slide原位雜交箱時(shí)，我們建議添加不少于20毫升的無核酸酶水，以確保信號明亮。
附錄 A: 其他FISH結(jié)果圖
宁波市|
包头市|
象山县|
精河县|
明星|
南充市|
江北区|
铜鼓县|
开江县|
武夷山市|
萍乡市|
同仁县|
湘阴县|
资溪县|
罗平县|
浙江省|
民县|
伊通|
颍上县|
息烽县|
建德市|
汉寿县|
邵阳县|
长子县|
大庆市|
桂东县|
安龙县|
禄劝|
上杭县|
郴州市|
宜良县|
布尔津县|
虹口区|
潢川县|
蓝田县|
南开区|
白山市|
辉南县|
清苑县|
浦东新区|
荣成市|