JACS 適用于流式細胞儀的鎂離子檢測探針 | 前沿用戶報道
今日文獻分享為2023年10月發(fā)表在JACS上的文章，“Ratiometric Fluorescent Sensors Illuminate Cellular Magnesium Imbalance in a Model of Acetaminophen-Induced Liver Injury.”通訊作者是來自紐約大學的Daniela Buccella教授(研究方向生物無機化學，化學生物學，分子成像)和來自西班牙生物科學合作研究中心(CIC bioGUNE)肝病實驗室的 María L. Martínez-Chantar教授。
2017年，Kazuya Kikuchi等設計了基于喹啉的三齒螯合 Mg2+ 的新型熒光探針，探針本身對鈣離子不敏感，適用于細胞內(nèi)動態(tài)檢測 Mg2+ 的濃度變化，但是這類探針在螯合 Mg2+ 后導致熒光淬滅，并且會受到 pH 影響(圖1)。在此基礎上，本文作者設計了比率型熒光探針(圖2)，可耐受 pH 變化，不受 Ca2+ 影響，其發(fā)光機制是利用喹啉母核的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移( internal charge transfer (ICT) )并且，利用此探針作者研究了藥物性肝損傷(DILI)細胞模型中CNNM4蛋白表達與Mg2+濃度之間的關(guān)系。( CNNM4:cyclinM4,細胞周期蛋白M家族，在 Mg2+ 跨細胞膜轉(zhuǎn)運中起關(guān)鍵作用。)
圖1 previous work(Chem. Commun., 2017,53, 10644-10647)
圖2 this work (J. Am. Chem. Soc. 2023, 145, 40, 21841-21850)
Mg2+正常生理水平濃度為0.5-1.2 mM,所設計探針 MagZet1 與 Mg2+ 結(jié)合后，最大吸收波長從 488 nm 藍移至430 nm，最大發(fā)射波長從 500 nm 紅移至 530 nm，其 Kd值在 0.14 mM ,其靈敏度滿足生理測試。并且，探針對其它二價金屬離子無明顯響應，競爭實驗也表明其對 Mg2+ 的選擇性更好。
圖3 (J. Am. Chem. Soc. 2023, 145, 40, 21841-21850)
在生理環(huán)境中，ATP 與鎂離子結(jié)合后發(fā)揮正常功能，所以 ATP 是天然的鎂離子生物螯合劑。低密度的探針或螯合劑傾向于形成探針-鎂離子-生物分子[MagZet1·Mg2+·ATP]三元配合物，這可能會干擾對游離的生物基質(zhì)中游離 Mg2+ 的研究。但是，根據(jù)探針與 MgATP 的解離常數(shù)為 100 mM,遠高于生理環(huán)境中鎂離子濃度。所以，MgATP 不會干擾 MagZet1 對游離的 Mg2+ 的檢測。
圖4 (J. Am. Chem. Soc. 2023, 145, 40, 21841-21850)
在進行細胞實驗之前，作者將探針用 AM(acetoxymethyl ester)修飾，增強其透膜性，觀察到細胞內(nèi)均勻的熒光信號，給予細胞 EDTA 和鈣離子載體處理，細胞內(nèi)熒光強度顯著降低，并且此比率型熒光探針適用于流式細胞術(shù)檢測胞內(nèi)鎂離子濃度。
圖5 (J. Am. Chem. Soc. 2023, 145, 40, 21841-21850)
最后作者探討了藥物肝損傷細胞模型中鎂離子濃度與 CNNM4 蛋白之間的關(guān)系，細胞內(nèi)經(jīng) 10 mM 對乙酰氨基酚處理 3h，觀察到細胞內(nèi)熒光降低，表明鎂離子濃度下降，對參與鎂離子轉(zhuǎn)運相關(guān)的蛋白表達量進行分析，發(fā)現(xiàn) CNNM4 表達上調(diào)，同時，RT-qPCR 也檢測到了 TRPM6 的上調(diào)，這在之前的患者樣本中并未發(fā)現(xiàn)。
圖6 (J. Am. Chem. Soc. 2023, 145, 40, 21841-21850)
總之，本文主要是基于之前文獻報道的 Turn-off 的探針進行結(jié)構(gòu)改造，1. 探針實現(xiàn)比率型熒光檢測鎂離子濃度變化；2. 探針對生理pH不敏感，且不受鈣離子干擾；3. 探針不受 MgATP 復合物干擾；4. 基于此探針的比率熒光檢測，使其適用于流式細胞術(shù)實現(xiàn)胞內(nèi)鎂離子的檢測，這是其最重要的突破；5. 利用此探針可以探究疾病發(fā)展過程中 Mg2+ 濃度與其相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白表達之間的關(guān)系。
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