工藝開發(fā)及優(yōu)化：下游蛋白質(zhì)純化技術(shù)的實(shí)踐與方案

發(fā)布時(shí)間：2024-1-26

　　蛋白質(zhì)純化技術(shù)，是生物下游技術(shù)中非常重要的組成部分，掌握蛋白質(zhì)純化技術(shù)的基本理論與操作，對(duì)相關(guān)專業(yè)學(xué)生的繼續(xù)深造以及就業(yè)發(fā)展均有重要作用【1】。重組蛋白的表達(dá)(尤其是使用細(xì)菌載體和宿主)是一項(xiàng)成熟的技術(shù)。難點(diǎn)在于如何將其以活化形式分離。

　　利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組蛋白一般可以分為上游、中游和下游三個(gè)部分。上游技術(shù)指包括基因重組與克隆，工程菌的構(gòu)建與表達(dá)等在內(nèi)的重組DNA技術(shù)，中游技術(shù)主要指工程菌或細(xì)胞的發(fā)酵技術(shù)，而下游技術(shù)則是指重組蛋白的分離純化技術(shù)【2】。

　　蛋白質(zhì)在細(xì)胞中一般以復(fù)雜的混合物形式存在，且不同的蛋白質(zhì)物理化學(xué)性質(zhì)差異很大。

　　因此，到目前為止，還沒有一個(gè)完全固定的方法能把任何一種蛋白質(zhì)從復(fù)雜的混合物中分離純化出來【2】。不同的重組蛋白具有不同的氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其物理、化學(xué)和生物學(xué)特性存在差異。我們也可以根據(jù)目標(biāo)蛋白與其他蛋白和裂解液的性質(zhì)差異設(shè)計(jì)合理的蛋白純化方案。

　　一般來說蛋白質(zhì)的純化可以分為3個(gè)連續(xù)的階段：捕獲，中度純化和精細(xì)純化(如下圖所示)。當(dāng)然在純化步驟之前通常還需要提取、澄清和濃縮最初的細(xì)胞裂解物【2】。

圖1

　　重組蛋白的純化是生物學(xué)研究中的重要技術(shù)。為了研究蛋白的特定功能和結(jié)構(gòu)，研究人員必須將重組蛋白從生物體中分離并純化。蛋白純化方法主要利用不同重組蛋白之間的相似性和差異性?？梢愿鶕?jù)蛋白之間的相似性去除非蛋白物質(zhì)，然后根據(jù)蛋白之間的差異分離純化目標(biāo)重組蛋白。

　　由于組成蛋白質(zhì)的氨基酸種類、數(shù)目、序列以及折疊形式各不相同，因此表達(dá)的重組蛋白物理和化學(xué)性質(zhì)差異很大，而重組蛋白的分離純化就是利用這種性質(zhì)上的差異，從而將目標(biāo)蛋白從細(xì)胞或培養(yǎng)液中分離純化出來。蛋白質(zhì)純化過程中常用的蛋白性質(zhì)包括：大小、形狀、荷電性、等電點(diǎn)、疏水性、溶解度、密度、與配體結(jié)合能力、與金屬鰲合能力以及某些特殊性質(zhì)(如耐熱性、抗蛋白酶)等。以這些性質(zhì)為基礎(chǔ)，人們己經(jīng)開發(fā)了多種用于蛋白質(zhì)分離純化的方法。具體見表所示【2】。

圖2

　　層析技術(shù)又稱色譜，是目前使用廣泛的，同時(shí)也是可靠的蛋白質(zhì)分離純化方法。其是基于樣品在固定相與流動(dòng)相中的分配差異，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白分離純化的方法，具有分離效率高、適用性廣、易于放大等優(yōu)點(diǎn)。常用的層析技術(shù)主要包括五大類：凝膠過濾層析、疏水作用層析、離子交換層析、親和層析以及反相層析，各層析技術(shù)原理如圖所示。近年來隨著技術(shù)的進(jìn)步，人們又在傳統(tǒng)層析技術(shù)的基礎(chǔ)上，開發(fā)了兼有多種模式的混合模式層析技術(shù)以彌補(bǔ)傳統(tǒng)層析技術(shù)在某些方面的不足，其中，疏水電荷誘導(dǎo)層析是具代表性的新型混合模式層析技術(shù)，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值【2】。

圖3 常用層析技術(shù)的分離原理【3】

　　純化技術(shù)的選擇與組合是對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行成功純化的關(guān)鍵，其最終目的就是經(jīng)過合理設(shè)計(jì)與優(yōu)化，能使獲得高收率、高純度以及低成本的目標(biāo)蛋白純化工藝。近年來，雖然有學(xué)者報(bào)道通過采用計(jì)算機(jī)為基礎(chǔ)的專家系統(tǒng)來預(yù)測和優(yōu)化純化工藝，但由于蛋白質(zhì)的復(fù)雜性，該方法還很難用于實(shí)際蛋白質(zhì)的分離純化過程。因此，目前人們?cè)谥贫兓桨笗r(shí)往往還是單純根據(jù)經(jīng)驗(yàn)或?qū)嶒?yàn)來選擇與組合純化技術(shù)。

　　重組表達(dá)系統(tǒng)下游工藝方案

　　原核表達(dá)體系