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2009-9-5
| 1. 細胞的沉降系數(shù) 由于分辨率取決于區(qū)帶寬度和徑向路徑的比值，沉降系數(shù)相差越大細胞區(qū)帶間距離越大，同一細胞株沉降系數(shù)分布越小細胞區(qū)帶越窄，分辨越高，越容易分離，在分離沉降系數(shù)相差很小的細胞時，應(yīng)盡可能保持起始細胞懸浮液區(qū)帶寬度窄小，加樣量少，梯度柱要長，即用長離心管進行分離，以彌補沉降系數(shù)對分辨率的不利影響。 2. 梯度的密度范圍 細胞密度必須大于梯度介質(zhì)的zui大密度，盡可能使用zui小密度和zui低黏度的梯度進行，以便在zui短的時間內(nèi)完成分離。 3. 梯度體積 分離細胞的數(shù)量和分離裝置不同，梯度的體積變化范圍很大，即梯度體積受所使用轉(zhuǎn)子和回收方法所制約，一般從5ml和1600ml不等。不像等密度離心，在很少的梯度介質(zhì)里進行速度分離很難成功。 4. 細胞裝樣量 由于細胞相互作用或細胞與細胞間的締合是細胞濃度的函數(shù)。有兩個問題，一是給梯度上加多少細胞能夠獲得所需的分辨率；二是細胞懸浮液的濃度多大才不至于引起細胞聚集并且能回收到適合研究用的細胞數(shù)量和細胞純度。由于各種組織來源的細胞差異很大，受污染細胞的數(shù)量和梯度介質(zhì)分辨本領(lǐng)所限，很難制定一種普遍適用的方法，一般根據(jù)經(jīng)驗確定或根據(jù)文獻報道方法進行，前面討論的理論方法在實際應(yīng)用中有一定局限性。 5. 離心轉(zhuǎn)速和時間 *分離離心轉(zhuǎn)速的選擇受若干因素所影響，包括細胞大小和密度、介質(zhì)的黏度和密度范圍。不管怎樣，所施加的離心力要足以使細胞在介質(zhì)中能夠移動，并且在適當(dāng)時間內(nèi)遷移到一定的距離范圍。若離心轉(zhuǎn)速太低，需要離心時間太長，如在高黏度介質(zhì)中分離心肌細胞時，離心時間太長會導(dǎo)致心肌細胞缺氧而死亡。若離心轉(zhuǎn)速太高，小細胞也快速通過梯度，甚至在較短時間內(nèi)到達管底，重新與大細胞混雜在一起。因此，在速度離心中，離心轉(zhuǎn)速和時間是至關(guān)重要的，為了減少不穩(wěn)定細胞受損或某些因子活性喪失，采用較高的轉(zhuǎn)速盡快完成分離。若較大的細胞沉降速度太長，可使用高粘性梯度介質(zhì)，使其自愛梯度中以合適的速度沉降。 6. 穩(wěn)定 分離細胞多在室溫（20~25℃）下進行，少數(shù)情況下在4℃下進行。 |
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