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正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

ME廣泛存在于微生物、培養(yǎng)細胞、動物和植物胞漿中，尤其在植物組織中活性較高。ME催化蘋果酸氧化脫羧的可逆反應，產生丙酮酸和CO2，以及伴隨NAD(P)+的還原反應，是蘋果酸代謝的關鍵酶。ME活性與生物合成和抗氧化密切相關。近年來植物ME活性測定較多，已經(jīng)成為抗氧化研究的熱點。根據(jù)輔酶專一性和對底物特異性的不同，可將ME分為NAD-ME(EC1.1.1.38)和NADP-ME(EC1.1.1.40)。

測定原理：

NADP-ME催化NADP+還原成NADPH，在340nm下測定NADPH增加速率。

需自備的儀器和用品:

紫外分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：100mL×1瓶，4℃保存。；

試劑一：液體30mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1瓶，-20℃保存； 臨用前加入20mL試劑一充分振蕩，溶解待用，用不完的試劑分裝后-20度保存，禁止反復凍融。

試劑三：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨用前加入2.5mL蒸餾水充分振蕩，溶解待用，用不完的試劑分裝后-20度保存，禁止反復凍融。

樣本的前處理： 

1、細菌、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；14000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。14000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1. 分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節(jié)波長至340nm，蒸餾水調零。

2、在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本和170μL試劑二，混勻，30℃孵育5min，加入20μL試劑三，混勻后立即記錄340nm處初始吸光值A1和 1min后的吸光值A2，計算ΔA=A2-A1。

NADP-ME活性計算：

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

NADP-ME（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T= 3215×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

NADP-ME（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T = 3215×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

NADP-ME（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T =6.43×ΔA

V反總：反應體系總體積，2×10-4 L；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，1 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。

b.用96孔板測定的計算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

NADP-ME（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V樣) ÷T= 6431×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

NADP-ME（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣÷V樣總×W) ÷T = 6431×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

NADP-ME（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣÷V樣總×500) ÷T =12.86×ΔA

V反總：反應體系總體積，2×10-4 L；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol/cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，1 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。

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