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貨號 | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 |
AS6321143 | 丙酮酸脫氫酶（PDH)測試盒（比色法） | 100管/96樣 |
AS6321143 | 丙酮酸脫氫酶（PDH)測試盒（比色法） | 50管/48樣 |
測定意義
PDH（EC 1.2.4.1）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，是丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(PDHC)催化丙酮酸氧化脫羧的限速酶，催化丙酮酸脫梭生成-TPP，把糖酵解和三羧酸循環(huán)連接起來。
測定原理
PDH催化丙酮酸脫氫，同時還原2,6-二氯酚靛酚（2,6-DCPIP），從而導(dǎo)致600nm光吸收的減少。
需自備的儀器和用品
可見分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制
試劑一：100mL×1瓶，-20℃保存；
試劑二：20mL×1瓶，-20℃保存；
試劑三：1.5mL×1支，-20℃保存；
試劑四：液體20mL×1瓶，4℃保存；
試劑五：粉劑×1瓶，4℃保存；
樣本的前處理
組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：
稱取約0.1g組織或收集500萬細胞，加入1mL試劑一和10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
將勻漿600g，4℃離心5min。
棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。
上清液即胞漿提取物，可用于測定從線粒體泄漏的PDH（此步可選做）。
在步驟④的沉淀中加入200uL試劑二和2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3秒，間隔10秒，重復(fù)30次），用于線粒體PDH活性測定。
測定步驟
分光光度計或酶標儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至605nm，蒸餾水調(diào)零。
樣本測定
（1）在試劑五中加入19mL試劑四充分溶解，置于37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴10min；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；
（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本和190μL試劑五，混勻，立即記錄605nm處初始吸光值A(chǔ)1和 1min后的吸光值A(chǔ)2，計算ΔA=A1-A2。
PDH活性計算
a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下
（1） 按樣本蛋白濃度計算
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。
PDH活性（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=952×ΔA÷Cpr
（2） 按樣本鮮重計算
單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。
PDH活性（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=192×ΔA÷W
（3） 按細菌或細胞密度計算
單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。
PDH活性（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.385×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù)，2.1×104 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T：反應(yīng)時間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。
b.用96孔板測定的計算公式如下
（1） 按樣本蛋白濃度計算
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。
PDH活性（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=1904×ΔA÷Cpr
（2） 按樣本鮮重計算
單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。
PDH活性（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=384×ΔA÷W
（3） 按細菌或細胞密度計算
單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。
PDH活性（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.77×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù)，2.1×104 L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T：反應(yīng)時間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。
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