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測(cè)定意義

果膠酶（pectinase）是一類分解果膠質(zhì)酶類的總稱，包括原果膠酶，果膠酯酶，多聚半乳糖醛酸酶和果膠裂解酶四大類，廣泛存在于植物果實(shí)和微生物中，主要用于食品、釀酒、環(huán)保、醫(yī)藥、紡織及日化用品行業(yè)。

測(cè)定原理

果膠酶水解果膠生成半乳糖醛酸，具有還原性醛基，與DNS試劑反應(yīng)生成紅棕色物質(zhì)，在540nm有特征吸收峰，測(cè)定540nm處吸光值變化可計(jì)算得果膠酶活性。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器

天平、低溫離心機(jī)、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋。

試劑組成和配制

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體20mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×2瓶，4℃保存；臨用前加入7.5mL試劑一，50℃加熱溶解，用不完的試劑4℃保存一周。

試劑三：液體20mL×1瓶，4℃避光保存。

酶液提取

1．組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2．細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后10000g，4℃離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

3. 細(xì)胞培養(yǎng)液等：直接檢測(cè)。

測(cè)定操作表

酶活性計(jì)算公式

1. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 3.9642x - 0.008；R2 = 0.9996；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，mg/mL；y為吸光值。

1．按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義：在50℃，pH3.5條件下，每毫克蛋白每小時(shí)分解果膠產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個(gè)酶活力單位。

果膠酶活性（mg/h/mg prot）= (ΔA+0.008) ÷3.9642×V反總÷（V樣×Cpr）÷T

= 2.523×(ΔA+0.008)÷Cpr

2．按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義：在50℃，pH3.5條件下，每克樣本每小時(shí)分解果膠產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個(gè)酶活力單位。

果膠酶活性（mg/h /g 鮮重）=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T

= 2.523×(ΔA+0.008)÷W

3. 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活性定義：在50℃，pH3.5條件下，每104細(xì)胞每小時(shí)分解果膠產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個(gè)酶活力單位。

果膠酶活性（mg/h /104cell）=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V反總÷（V樣×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總）÷T

= 2.523×(ΔA+0.008)÷細(xì)胞數(shù)量

4．細(xì)胞培養(yǎng)液

酶活性定義：在50℃，pH3.5條件下，每毫升培養(yǎng)液每小時(shí)分解果膠產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個(gè)酶活力單位。

果膠酶活性（mg/h /mL）=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V反總÷V樣÷T=2.523×(ΔA+0.008)

V反總：反應(yīng)總體積，0.15mL；V樣：反應(yīng)中樣本體積，0.03mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W，樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，0.5h

2. 用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 1.9821x - 0.008，R2 = 0.9996；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，mg/mL；y為吸光值。

1．按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義：在50℃，pH3.5條件下，每毫克蛋白每小時(shí)分解果膠產(chǎn)。生1mg半乳糖醛酸為一個(gè)酶活力單位。

果膠酶活性（mg/h/mg prot）=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反總÷（V樣×Cpr）÷T

= 5.045×(ΔA+0.008)÷Cpr

2．按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義：在50℃，pH3.5條件下，每克樣本每小時(shí)分解果膠產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個(gè)酶活力單位。

果膠酶活性（mg/h/g 鮮重）=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T

= 5.045×(ΔA+0.008)÷W

3. 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活性定義：在50℃，pH3.5條件下，每104細(xì)胞每小時(shí)分解果膠產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個(gè)酶活力單位。

果膠酶活性（mg/h /104cell）=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反總÷（V樣×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總）÷T

= 5.045×(ΔA+0.008)÷細(xì)胞數(shù)量

4．細(xì)胞培養(yǎng)液

酶活性定義：在50℃，pH3.5條件下，每毫升培養(yǎng)液每小時(shí)分解果膠產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個(gè)酶活力單位。

果膠酶活性（mg/h/mL）=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反總÷V樣÷T=5.045×(ΔA+0.008)

V反總：反應(yīng)總體積，0.15mL；V樣：反應(yīng)中樣本體積，0.03mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W，樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，0.5h

注意事項(xiàng)

1. 試劑二若有沉淀析出，請(qǐng)置于50℃加熱溶解。

2. 測(cè)定之前請(qǐng)先做預(yù)實(shí)驗(yàn)，如果吸光值較高或較低，請(qǐng)用提取液做適當(dāng)?shù)南♂尰蛘呒哟髽颖玖?，并在?jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)或者以實(shí)際加入的樣本體積參與計(jì)算。

3. 煮沸樣本建議在沸水中煮沸10分鐘，以將酶滅活。

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