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測(cè)定意義：

C4H又稱反式肉桂酸-4-單氧化酶，多存在于高等植物、酵母、菌類中，該酶催化肉桂酸羥化作用產(chǎn)生4-香豆酸鹽，是苯丙烷途徑中繼L-苯丙氨解氨酶之后的第二個(gè)關(guān)鍵酶。

測(cè)定原理：

C4H催化肉桂酸和NADP生成4-香豆酸鹽和NADPH，在340nm下測(cè)定NADPH生成速率，即可反映C4H活性。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：100mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體25 mL×1瓶， 4℃保存；

試劑二：粉劑×2瓶，-20℃保存；

粗酶液提取：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1. 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 樣本測(cè)定

（1）取試劑二一瓶，加入10mL試劑一充分溶解混勻，置于37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴5min；現(xiàn)配現(xiàn)用（配好后24h內(nèi)用完）；

（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本和190μL試劑二，混勻，立即記錄340nm處初始吸光值A(chǔ)1和 5min后的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA=A2-A1。
 

C4H活性計(jì)算：

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1 nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

C4H（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織每分鐘產(chǎn)生1 nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

C4H（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=643×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1 nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

C4H（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=1.286×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。

b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1 nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

C4H（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織每分鐘產(chǎn)生1 nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

C4H（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=1286×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1 nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

C4H（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=2.572×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。

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