乳鐵蛋白純化工藝介紹
乳鐵蛋白(lactoferrin,LF)是乳腺上皮所分泌的糖蛋白，是轉(zhuǎn)鐵蛋白家族中的一種非血紅素鐵結(jié)合蛋白，主要存在于乳汁中的乳清蛋白部分，母乳中的乳鐵蛋白含量約為2?3g/L，牛乳中的乳鐵蛋白含量約為0.8g/L。
乳鐵蛋白雖然含量較低，但有增強(qiáng)免疫力、抗菌作用、抗病毒活性、調(diào)節(jié)腸道菌群、促進(jìn)鐵吸收、抗氧化作用、抗炎作用、促進(jìn)生長發(fā)育、預(yù)防心血管疾病、改善口腔健康等功效，在人體的健康維護(hù)和生理調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，對嬰幼兒的生長發(fā)育以及成年人的健康都有著重要意義。
乳鐵蛋白是一條700個氨基酸組成的糖基化修飾的肽鏈，折疊后形成兩個同源的球狀域，即N-環(huán)和C-環(huán)。這兩個域由一段短的α-螺旋連接，每個域進(jìn)一步分為兩個子域（亞域），即N1、N2和C1、C2，每個域包含一個鐵結(jié)合位點和一個糖基化位點。分子量約為80 kDa。因結(jié)合鐵離子，純化后的乳鐵蛋白呈紅色。乳鐵蛋白的三維結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出一種典型的球狀結(jié)構(gòu)，直徑約為10 nm。其表面帶有正電荷，這有助于與陰離子生物化合物結(jié)合。
乳鐵蛋白具有多種重要功能，已被中國、美國作為食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑用于運(yùn)動和功能性食品。部分產(chǎn)品已被歐洲藥品管理局(EMEA) 與美國食品藥品管理局(FDA) 評證為孤兒藥品。
資料顯示，荷蘭DMV公司，為較大的乳鐵蛋白供應(yīng)商，歐洲絕大部分奶粉所采用的乳鐵蛋白即由其供應(yīng)。其生產(chǎn)的乳鐵蛋白純度高達(dá)97%，是通過美國FDA的GRAS認(rèn)證（認(rèn)可安全使用物質(zhì)）的乳鐵蛋白原料。
乳鐵蛋白含量較低，需經(jīng)過大量預(yù)處理步驟，制備得到粗品，再進(jìn)行精細(xì)純化。
文獻(xiàn)[1]，利用牛初乳作為起始物料，經(jīng)過離心脫脂、凝乳酶酶解、離心分離酪蛋白沉淀；離心母液為乳清蛋白液，經(jīng)超濾分級，按照＞200KD（酪蛋白），＞100KD（球蛋白），＞50KD（乳鐵蛋白粗品），＞10KD（乳白蛋白）分段，制備得到50KD~100KD的乳鐵蛋白粗品，再經(jīng)陽離子交換樹脂純化，脫鹽濃縮、-35℃~-41℃真空度47Pa冷凍干燥，得到高純度的的乳鐵蛋白粉。
文獻(xiàn)[2]，利用牛奶做起始物料，采用硫酸銨分級沉淀除酪蛋白、免疫球蛋白，最終離心上清調(diào)pH8.5，采用80%硫酸銨沉淀制得乳鐵蛋白沉淀粗品，再通過Sephadex G-100，制備得到純度為92%的乳鐵蛋白，收異構(gòu)體和鐵離子結(jié)合狀態(tài)的影響，乳鐵蛋白有不同分子量表現(xiàn)形式，純化后的乳鐵蛋白在475nm有最大吸收峰。
文獻(xiàn)[3]，重組枯草芽孢桿菌產(chǎn)乳鐵蛋白 N 葉，經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)、菌體收集、破菌、離心、親和層析、超濾濃縮、凝膠層析等多步純化，1g菌體能制備得到23.5mg純蛋白。
文獻(xiàn)[4]匯總?cè)殍F蛋白分離純化方法比較如下：
分離方法 | 優(yōu)點 | 缺點 | 應(yīng)用范圍 |
離子交換色譜法 | 操作簡單、可持續(xù)進(jìn)樣 | 產(chǎn)量低、產(chǎn)品純度低、成本高 | 實驗室等小規(guī)模 |
鹽析法 | 成本低、操作簡單 | 產(chǎn)量低、產(chǎn)品純度低 | 工業(yè)生產(chǎn)低純度的乳鐵蛋白 |
超濾法 | 操作簡便、費(fèi)用低 | 產(chǎn)品純度低、易堵塞膜孔 | 工業(yè)生產(chǎn) |
親和色譜法 | 操作簡單、分離效果好、產(chǎn)品純度較高、產(chǎn)品無生物活性損失 | 成本高、不適合商業(yè)化生產(chǎn) | 實驗室等小規(guī)模 |
離子交換色譜法結(jié)合超濾法 | 產(chǎn)品純度較高、分離效果較好 | 操作步驟復(fù)雜,成本較高 | 實驗室等小規(guī)模 |
鹽析法結(jié)合凝膠層析法 | 產(chǎn)品純度較高 | 操作步驟復(fù)雜 | 實驗室等小規(guī)模 |
模擬移動床色譜 | 成本低、分離效果好連續(xù)操作、處理量大 | 速度慢、不易控制 | 工業(yè)生產(chǎn) |
上述方法各有優(yōu)缺點。
超濾法主要利用蛋白的分子量大小差異進(jìn)行分級分離，膜過濾處理量大、自動化程度高，但所得產(chǎn)品純度低，易堵膜孔，只要解決膜過濾堵塞問題，仍為大規(guī)模制備乳鐵蛋白粗品的好方法。
離子交換法雖然操作相對復(fù)雜，但利用乳鐵蛋白和其他蛋白的性質(zhì)差異，制備高純度乳鐵蛋白。
親和色譜法具有較高的選擇性，可從粗品蛋白直接提純目標(biāo)蛋白純度，但親和層析材料價格較貴，還未能用于大宗產(chǎn)品的制備生產(chǎn)。
應(yīng)用超濾法結(jié)合離子交換樹脂法，通過料液預(yù)處理、超濾分級方法，可提高離子交換樹脂效率。
博納科技致力于膜應(yīng)用工藝的開發(fā)，在天然提取蛋白、發(fā)酵來源蛋白的澄清過濾、分級、脫鹽、濃縮方面，接觸和解決了大量物料過濾難題，積累的豐富的工藝和工程經(jīng)驗。牛奶制品產(chǎn)業(yè)產(chǎn)品豐富，生產(chǎn)工藝多樣，如酪蛋白濃縮、乳清蛋白回收、乳清蛋白脫糖脫鹽、乳清蛋白分級等，應(yīng)用了大量膜過濾工藝。隨著產(chǎn)品類型的細(xì)分，在物料預(yù)處理、膜選型、膜過濾參數(shù)優(yōu)化等方面，仍值得繼續(xù)探索與提高。
參考文獻(xiàn)：
1]馬闖,蘇政波,李瑞國,等.從牛初乳中提取酪蛋白、免疫球蛋白、乳白蛋白、乳鐵蛋白生產(chǎn)工藝的研究[J].山東食品發(fā)酵, 2004(4):2.
[2]曲練達(dá)等. "乳鐵蛋白的分離純化." 中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家畜傳染病學(xué)分會第六屆理事會第二次會議暨教學(xué)專業(yè)委員會第六屆代表大會論文集 2006.
[3]金亮,李利宏,張榮珍,等.重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)乳鐵蛋白N葉工藝優(yōu)化[J].生物工程學(xué)報, 2022, 38(7):2628-2638.
[4]王雨奇,孫翠翠,杜鵬.乳鐵蛋白分離純化及功能特性的研究進(jìn)展[J].乳品與人類, 2023(2):44-52.
采購中心
