【參數(shù)信息】

英文名稱：Alexa Fluor 555 Concanavalin A

中文名稱：AF555標(biāo)記伴刀豆球蛋白A

激發(fā)峰(Ex)：556nm

發(fā)射峰(Em)：571nm

純度：≥95%

儲(chǔ)存條件：-20℃避光干燥

生產(chǎn)廠商：西安強(qiáng)化生物科技

【簡(jiǎn)單概述】（AF555標(biāo)記伴刀豆球蛋白A）

AF 555 ConA 是一種熒光標(biāo)記的刀豆蛋白A（Concanavalin A, ConA）探針，主要用于生物醫(yī)學(xué)研究中的糖類識(shí)別和檢測(cè)。

AF555，即Alexa Flour 555，是Alexa Fluor家族中的一種橘黃色-橙紅色熒光染料，是Sulfo-Cy3的類似物，常用于代替Cy3、TAMRA染料使用。

AF555染料的激發(fā)譜和發(fā)射譜具有較好的對(duì)稱性，并且都有非常典型的肩峰，激發(fā)譜的肩峰巧合處于532nm激光束附近，在共聚焦實(shí)驗(yàn)中常常被用于激發(fā)AF555染料。

AF555染料的激發(fā)峰和發(fā)射峰譜帶恰好處于黃色光與紅色光過(guò)度區(qū)域，因此，激發(fā)光往往呈黃色或者黃綠色，發(fā)射出來(lái)的熒光為黃紅色（橙紅色），這種熒光色彩和AF488的綠色熒光一樣，都是肉眼敏感的彩色光，在熒光顯微鏡下很容易辨認(rèn)出來(lái)。

刀豆蛋白A(Concanavalin A,Con A)無(wú)血型特異性,但選擇性結(jié)合發(fā)現(xiàn)于各種糖蛋白、糖脂和糖類分子上的α-甘露糖基和α-葡糖基殘基，需要Ca2+和Mn2+離子存在才能顯示活性。Con A適用于碳水化合物研究,糖蛋白純化,酶標(biāo)記,細(xì)胞膜研究,細(xì)胞凝集,和細(xì)胞分型研究。

【常見問(wèn)題】

（一）弱信號(hào)或無(wú)熒光染色

可能原因：

目標(biāo)糖基化位點(diǎn)濃度低：樣本（如細(xì)胞表面或糖蛋白）中ConA可結(jié)合的α-甘露糖或α-葡萄糖殘基分布稀疏或表達(dá)量低。

試劑濃度或孵育時(shí)間不足：AF555-ConA工作濃度過(guò)低或與樣本孵育時(shí)間過(guò)短，導(dǎo)致結(jié)合不充分。

熒光淬滅（光漂白）：操作或儲(chǔ)存過(guò)程中未嚴(yán)格避光，導(dǎo)致熒光染料降解。

樣本處理不當(dāng)：固定過(guò)程（如使用高濃度醛類固定劑或固定時(shí)間過(guò)長(zhǎng)）可能掩蓋糖基化表位；或透化不充分使ConA無(wú)法接觸細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)。

解決方法：

優(yōu)化AF555-ConA的工作濃度并進(jìn)行孵育時(shí)間梯度測(cè)試，以確定條件。

全程避光操作：使用避光容器保存試劑和孵育樣本，縮短顯微鏡觀察時(shí)的曝光時(shí)間，并將試劑分裝后于-20℃以下避光保存，避免反復(fù)凍融。

優(yōu)化樣本制備流程：嘗試縮短固定時(shí)間、更換固定劑（如嘗試不同的醛類濃度）或采用抗原修復(fù)技術(shù)；確保透化步驟充分。

設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照：使用已知能良好結(jié)合ConA的樣本（如某些細(xì)胞系或糖蛋白）驗(yàn)證試劑活性和實(shí)驗(yàn)流程。

（二）非特異性染色或高背景

可能原因：

非特異性結(jié)合：ConA可能與其他糖類或細(xì)胞成分發(fā)生非特異性結(jié)合。

未結(jié)合的游離染料：標(biāo)記過(guò)程中去除的游離AF555染料可能導(dǎo)致背景升高。

封閉不充分：實(shí)驗(yàn)前樣本未經(jīng)過(guò)有效的封閉處理。

解決方法：

優(yōu)化封閉條件：使用合適的封閉劑（如BSA、血清）對(duì)樣本進(jìn)行充分封閉。

確保試劑純化充分：如果是自行標(biāo)記，確保通過(guò)透析或柱層析等方法去除未結(jié)合的熒光染料。

滴定試劑濃度：使用有效濃度的AF555-ConA有助于減少非特異性結(jié)合。

（三）pH值的影響

特別提示：ConA的寡聚化狀態(tài)和結(jié)合活性受pH值影響。其在中性或堿性條件下常以四聚體形式存在，而在酸性條件（pH < 5）下可能形成二聚體，這可能影響其結(jié)合能力和熒光信號(hào)。

解決方法：

確保反應(yīng)和孵育緩沖液處于適宜的pH范圍（通常為中性），以維持ConA的結(jié)合構(gòu)象。

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