【參數(shù)信息】（AF647標(biāo)記膜聯(lián)蛋白V）

英文名稱：AF647 Annexin V

吸收波長(zhǎng)：655 nm

發(fā)射波長(zhǎng)：680 nm

純度：≥95%

儲(chǔ)存條件：-20℃避光干燥

生產(chǎn)廠商：西安強(qiáng)化生物科技

【簡(jiǎn)單概述】（AF647標(biāo)記膜聯(lián)蛋白V）

Annexin V (or Annexin A5) belongs to the phospholipid-binding Annexin family of intracellular proteins. In flow cytometry and fluorescent microscopy, Annexin V is commonly used to detect apoptotic cells by its ability to specifically bind to phosphatidylserine, which migrates from the inner to the outer leaflet of the plasma membrane during the early stages of apoptosis.

膜聯(lián)蛋白 V（或膜聯(lián)蛋白 A5）屬于磷脂結(jié)合膜聯(lián)蛋白家族的細(xì)胞內(nèi)蛋白。在流式細(xì)胞術(shù)和熒光顯微鏡中，膜聯(lián)蛋白 V 通常用于檢測(cè)凋亡細(xì)胞，因?yàn)樗軌蚺c磷脂酰絲an酸特異性結(jié)合，磷脂酰絲an酸在細(xì)胞死亡的早期階段從質(zhì)膜的內(nèi)小葉遷移到外小葉。

This Annexin V is a lyophilized conjugate with AF 647, a bright, photostable, hydrophilic far-red fluorophore with spectral characteristics similar to Cyanine5 (absorption max. at 655 nm, emission max. at 680 nm). Far-red fluorescent tags with excitation above 600 nm and emission further than 650 nm are valuable for imaging techniques because of the lower background autofluorescence at these wavelengths.

該膜聯(lián)蛋白 V 是與 AF 647 的凍干偶聯(lián)物，AF 647 是一種明亮、光穩(wěn)定、親水的遠(yuǎn)紅外熒光團(tuán)，具有與花青 5 相似的光譜特征（在 655 nm 處吸收，在 680 nm 處發(fā)射）。激發(fā)波長(zhǎng)高于 600 nm、發(fā)射波長(zhǎng)高于 650 nm 的遠(yuǎn)紅熒光標(biāo)簽對(duì)于成像技術(shù)很有價(jià)值，因?yàn)檫@些波長(zhǎng)的背景自發(fā)熒光較低。

【核心實(shí)驗(yàn)流程】

（一）細(xì)胞預(yù)處理

懸浮細(xì)胞

收集細(xì)胞至離心管，1000-2000 rpm離心5分鐘，棄上清 。

用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞1-2次（離心條件同上）。

注意：洗滌需輕柔，避免機(jī)械損傷導(dǎo)致假陽(yáng)性。

貼壁細(xì)胞

使用不含EDTA的yi酶消化（EDTA會(huì)抑制Annexin V結(jié)合）。

消化時(shí)間需優(yōu)化：過(guò)短易損傷細(xì)胞，過(guò)長(zhǎng)會(huì)降解Annexin V。

關(guān)鍵步驟：消化后加入含血清的培養(yǎng)液中和yi酶，再離心收集細(xì)胞。

用PBS洗滌細(xì)胞2次（離心條件同上）。

（二）染色體系制備

緩沖液配制

將10×或4× Annexin V結(jié)合緩沖液用去離子水稀釋至1×工作液（如：1 mL 10×緩沖液 + 9 mL水）。

細(xì)胞重懸

用100-200 μL 1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整密度至1-5×10? cells/mL 。

（三）染色步驟

染料添加（避光操作）

加入5 μL Annexin V-AF647至100 μL細(xì)胞懸液。

加入死亡染料（二選一）：

PI（5 μL） ：常用，檢測(cè)晚期凋亡/壞死。

7-AAD（5-10 μL） ：替代PI，光譜兼容性更佳。

混勻與孵育

輕柔吹吸或渦旋混勻。

室溫（20-25℃）避光孵育10-30分鐘（不同廠商建議時(shí)間有差異）。

孵育中可重懸細(xì)胞2-3次以提升染色均勻性。

（四）檢測(cè)前處理

稀釋與洗滌（根據(jù)方法選擇）

一步法：直接加入400 μL 1×結(jié)合緩沖液稀釋，立即上機(jī)。

兩步法：先離心棄染液，再用緩沖液重懸，分辨率更高。

注意：樣本需在1小時(shí)內(nèi)檢測(cè)，否則置于冰上避光保存。

（五）檢測(cè)與分析

流式細(xì)胞儀

空白管調(diào)電壓，單染管（僅Annexin V或僅PI）調(diào)補(bǔ)償。

通道設(shè)置：

Annexin V-AF647：APC通道（Ex/Em ≈ 650/665 nm）。

PI：PE-Cy5或PerCP通道（Ex/Em ≈ 535/617 nm）。

熒光顯微鏡

Annexin V-AF647用APC濾光片，PI用Cy3/Texas Red濾光片。

【相關(guān)試劑】

ATTO 610 TCO

ATTO 620 TCO

ATTO 633 TCO

ATTO 655 TCO

ATTO 488 TCO

ATTO 680 TCO

ATTO 700 TCO

Annexin V-iFluor 633標(biāo)記

Annexin V-iFluor 350標(biāo)記

Annexin V-iFluor 488標(biāo)記

Annexin V-iFluor 555標(biāo)記

Annexin V-iFluor 594標(biāo)記

Annexin V-iFluor 647標(biāo)記

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