標(biāo)題:XFD488疊氮化物
【參數(shù)信息】
英文名稱(chēng):XFD488 azide
中文名稱(chēng):XFD488 疊氮化物;AF 488疊氮化物 等同于Alexa Fluor 488
Ex (nm):499
Em (nm):520
分子量:861.04
溶劑:DMSO
純度:≥95%
儲(chǔ)存條件:-20℃避光干燥
生產(chǎn)廠商:西安強(qiáng)化生物科技
【簡(jiǎn)單概述】(XFD488疊氮化物)
Alexa Fluor 488 azide, a green fluorescent protein, undergoes copper-catalyzed click reactions with terminal alkynes.
Beyond serving as a highly bright and light-stable fluorophore compatible with flow cytometry, microscopy, and HCS systems, it also functions as a bioorthogonal or biological hapten for applications requiring signal amplification.
綠色熒光 Alexa Fluor 488 疊氮化物可通過(guò)銅催化的點(diǎn)擊反應(yīng)與末端炔烴發(fā)生反應(yīng)。
除了作為與流式細(xì)胞分析、顯微鏡和 HCS 配合使用的極為明亮且光穩(wěn)定的熒光基團(tuán)外,Alexa Fluor 488 還可作為生物正交或生物學(xué)半抗原用于需要信號(hào)放大的應(yīng)用。
【常見(jiàn)問(wèn)題】
(一)點(diǎn)擊標(biāo)記樣品無(wú)信號(hào)或特異性信號(hào)非常低,如何提高信號(hào)?
(1)當(dāng)銅離子在合適的化合價(jià)時(shí),點(diǎn)擊反應(yīng)才有效。除了DIBO炔烴-疊氮化物反應(yīng)外,在缺乏銅離子的條件下,疊氮化物和炔烴不會(huì)相互反應(yīng)。確保在制備之后、二價(jià)銅(II)濃度高時(shí),立即使用點(diǎn)擊反應(yīng)混合物。
(2)不要使用已經(jīng)變黃的添加劑緩沖液;其必須無(wú)色狀態(tài)下才有活性。
(3)為確保TdT酶和點(diǎn)擊反應(yīng)試劑能夠到達(dá)核內(nèi),細(xì)胞需要充分地固定和通透。為確保有足量的TdT能進(jìn)入,組織樣品需要用蛋白酶K或其他蛋白水解酶消化。
(4)部分試劑能結(jié)合到銅離子上,并減少其足以催化點(diǎn)擊反應(yīng)的有效濃度。click反應(yīng)前,不要在任何緩沖液或試劑中引入任何金屬螯合劑。避免緩沖液和試劑中引入其他可能被氧化或還原的金屬離子。進(jìn)行click反應(yīng)前,可能需要向細(xì)胞或組織樣品加入額外的洗滌步驟。
(5)您可以用新鮮的試劑再次進(jìn)行點(diǎn)擊反應(yīng),從而提高信號(hào)。將點(diǎn)擊反應(yīng)的時(shí)間延長(zhǎng)至超過(guò)30分鐘,并不會(huì)提高信號(hào)。用新鮮的點(diǎn)擊反應(yīng)試劑再次進(jìn)行30分鐘的孵育,可有效提高標(biāo)記效率。
(6)自己的細(xì)胞可能沒(méi)有凋亡。準(zhǔn)備一份DNase I處理的陽(yáng)性對(duì)照,驗(yàn)證TdT酶反應(yīng)和點(diǎn)擊標(biāo)記反應(yīng)是否正確進(jìn)行。
(二)Click-iT EdU TUNEL標(biāo)記樣品成像時(shí),觀測(cè)到較高的非特異性本底。這是什么原因造成的?如何降低本底干擾?
click反應(yīng)在疊氮化物和炔烴類(lèi)間選擇性。生物體系不可能有其他副反應(yīng)。任何非特異性背景都是由于染料和多種細(xì)胞內(nèi)組分的非共價(jià)連接。Select FX信號(hào)增強(qiáng)劑在click反應(yīng)后減少染料的電荷為基礎(chǔ)的非特異性連接方面效果不明顯;我們不推薦將其與Click-iT檢測(cè)試劑一同使用。
合適的減少背景的方法是增加BSA清洗的次數(shù)。
在同樣的過(guò)程和檢測(cè)條件下做無(wú)染料或無(wú)click反應(yīng)對(duì)照,以證實(shí)背景確實(shí)是由于染料而不是自發(fā)熒光。
同時(shí)應(yīng)該在無(wú)TdT酶的對(duì)照樣品進(jìn)行完整的click反應(yīng)來(lái)證實(shí)click反應(yīng)信號(hào)的特異性。
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