立克次體IgM抗體檢測試劑盒（間接免疫熒光法）

                                                                           僅供體外診斷用

預(yù)期用途

R21M-120這個貨號的試劑盒用于同時半定量檢測人血清或血漿中針對斑點熱和斑疹傷寒立克次體的IgM類抗體,作為診斷該病原體感染的輔助工具。

前言說明

斑點熱群立克次體在世界各地發(fā)現(xiàn)，由蜱和螨（小株立克次體）介導(dǎo)，其通過叮咬傳播感染立克次體在西半球發(fā)現(xiàn)，以及康氏立克次體（南歐斑疹熱）在地中海地區(qū)、非洲、印度和亞洲大部分地區(qū)發(fā)現(xiàn)。許多其他種類的斑點熱立克次體也在廣泛的地區(qū)被發(fā)現(xiàn)。

斑疹傷寒群立克次體是由受感染的跳蚤和虱子傳播的。這一組包括斑疹傷寒立克次體（地方性斑疹傷寒）和普氏立克次氏體（流行性斑疹傷寒），這兩種物種在世界各地被發(fā)現(xiàn)。隨后的感染引起特異性的抗體反應(yīng)，可以被檢測并用作識別被感染的人的間接手段。

檢測原理

立克次體IgM抗體檢測試劑盒R21M-120中的IFA載玻片利用純化的康氏立克次體和斑疹傷寒立克次體作為每個載玻片孔內(nèi)的單獨底物抗原。血清樣本至少1:64稀釋后加入載玻片孔中與立克次體血清抗體發(fā)生反應(yīng)，然后洗滌除去未反應(yīng)的血清蛋白，并加入熒光共軛物以標(biāo)記抗原-抗體復(fù)合物。進一步孵育后再次洗滌除去未反應(yīng)的共軛物，使用標(biāo)準(zhǔn)的熒光顯微鏡可觀察反應(yīng)結(jié)果，其中陽性反應(yīng)被視為小的清晰的熒光棒狀形式分散在紅色染色的背景基質(zhì)中。陰性反應(yīng)被視為非染色（紅色）背景或不同于陽性對照孔中看到的熒光。然后，可以在更高的稀釋度下重新測試陽性反應(yīng)，以確定最高的反應(yīng)性稀釋度或終點稀釋度。

所需材料（試劑盒未提供）

1）純化水（蒸餾水或去離子水）

2）干凈的250或500mL洗瓶

3）洗浴池

4）試管

5）精密移液器：100μL

6）24x50mmm蓋玻片

7）熒光顯微鏡（具有FITC（最大激發(fā)波長490 nm，平均發(fā)射波長530 nm）和400倍放大倍數(shù)）

8）37℃水浴鍋或培養(yǎng)箱

9）濕盒

儲存與處理

試劑盒儲存于2-8℃，使用前于先將試劑盒平衡至室溫（20-25℃）后,再打開瓶蓋或封片

樣本收集

先將全血放置凝結(jié)后再離心分離血清，轉(zhuǎn)移到一個無菌的密封容器，儲存于2-8℃，如果血清樣本保存時間超過5天,需置于-20℃或更低保存，急性期樣本，立即采集；恢復(fù)期樣本，需每隔2周或4周，采血一次，觀察滴度變化。

樣品和試劑的準(zhǔn)備

洗滌緩沖液的準(zhǔn)備

加PBS包裝組分于1L的純化水中,混勻.

篩查稀釋液

首先，用稀釋液1:16稀釋血清樣本，混合均勻后至少反應(yīng)5分鐘，然后高速離心以除去聚集的IgG；取10μL上清液，加入30μL洗滌緩沖液，混合均勻，得到最終稀釋度為1:64的篩查稀釋液

實驗步驟

1）用洗滌緩沖液連續(xù)2倍稀釋陽性質(zhì)控品，包括一份高于和一份低于終點滴度（1:512）的稀釋度，所有提供的質(zhì)控品均已1:64預(yù)稀釋

2）將10μL稀釋后的血清加入相應(yīng)的孔中并標(biāo)記，將上述制備的所有陽性質(zhì)控品以及1滴陰性質(zhì)控品加入相應(yīng)的孔中，樣本應(yīng)加至孔的頂部或底部，避免加至含抗原微點的中部

3）將載玻片放入濕盒中，并在37℃下孵育30分鐘

4）棄去孔中內(nèi)容物，用洗瓶輕輕沖洗孔，一次沖洗1排，以避免樣本混合，然后將載玻片浸泡在含有PBS的容器中至少5分鐘

5）在蒸餾水中短暫浸泡后晾干

6）每孔加入1滴共軛物，將載玻片放入濕盒中，在37℃下孵育30分鐘，孵育期間應(yīng)避光

7）重復(fù)洗滌步驟

8）每孔加入1-3滴封固劑，并蓋上蓋玻片

9）在熒光顯微鏡下放大400倍觀察結(jié)果，并與陰性和陽性對照孔進行比較，載玻片可在2-8℃下避光保存24小時

質(zhì)控說明

每次檢測都要設(shè)陰性對照和稀釋陽性對照。陰性對照顯示陰性樣本的顯色情況，沒有明顯的立克次體體染色特征。陽性對照應(yīng)該在1:256至1:1024之間有最大終點稀釋（即4-16倍的瓶內(nèi)陽性對照的稀釋度）。1:512稀釋度的熒光強度可以作為臨界(Cut-off)進行判讀。如果對照品的顯色情況與上述描述不符，檢測結(jié)果應(yīng)視為無效。應(yīng)該重新檢查試劑組分和操作步驟，重新檢測。

結(jié)果判定

陽性反應(yīng)孔內(nèi)會清晰地顯現(xiàn)明亮的（至少1+）染色多形短棒狀形態(tài)，通過與陽性質(zhì)控和陰性質(zhì)控比較大小,外觀和熒光強度等,各種形態(tài)都和陽性質(zhì)控明顯不同的則判定為非特異性反應(yīng).

初次感染時，(IFA)免疫熒光檢測IgG和IgM檢測結(jié)果都迅速上升。IgM在發(fā)病的第三周達到高峰，并持續(xù)2-3個月陽性。IgG在發(fā)病7-12周時達到高峰，之后緩慢下降，但下降速度比IgM水平慢得多，最終持續(xù)大約12個月陽性。

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