立克次體IgM抗體檢測(cè)試劑盒（間接免疫熒光法）

                                                                           僅供體外診斷用

預(yù)期用途

R21M-120這個(gè)貨號(hào)的試劑盒用于同時(shí)半定量檢測(cè)人血清或血漿中針對(duì)斑點(diǎn)熱和斑疹傷寒立克次體的IgM類抗體,作為診斷該病原體感染的輔助工具。

前言說明

斑點(diǎn)熱群立克次體在世界各地發(fā)現(xiàn)，由蜱和螨（小株立克次體）介導(dǎo)，其通過叮咬傳播感染立克次體在西半球發(fā)現(xiàn)，以及康氏立克次體（南歐斑疹熱）在地中海地區(qū)、非洲、印度和亞洲大部分地區(qū)發(fā)現(xiàn)。許多其他種類的斑點(diǎn)熱立克次體也在廣泛的地區(qū)被發(fā)現(xiàn)。

斑疹傷寒群立克次體是由受感染的跳蚤和虱子傳播的。這一組包括斑疹傷寒立克次體（地方性斑疹傷寒）和普氏立克次氏體（流行性斑疹傷寒），這兩種物種在世界各地被發(fā)現(xiàn)。隨后的感染引起特異性的抗體反應(yīng)，可以被檢測(cè)并用作識(shí)別被感染的人的間接手段。

檢測(cè)原理

立克次體IgM抗體檢測(cè)試劑盒R21M-120中的IFA載玻片利用純化的康氏立克次體和斑疹傷寒立克次體作為每個(gè)載玻片孔內(nèi)的單獨(dú)底物抗原。血清樣本至少1:64稀釋后加入載玻片孔中與立克次體血清抗體發(fā)生反應(yīng)，然后洗滌除去未反應(yīng)的血清蛋白，并加入熒光共軛物以標(biāo)記抗原-抗體復(fù)合物。進(jìn)一步孵育后再次洗滌除去未反應(yīng)的共軛物，使用標(biāo)準(zhǔn)的熒光顯微鏡可觀察反應(yīng)結(jié)果，其中陽(yáng)性反應(yīng)被視為小的清晰的熒光棒狀形式分散在紅色染色的背景基質(zhì)中。陰性反應(yīng)被視為非染色（紅色）背景或不同于陽(yáng)性對(duì)照孔中看到的熒光。然后，可以在更高的稀釋度下重新測(cè)試陽(yáng)性反應(yīng)，以確定最高的反應(yīng)性稀釋度或終點(diǎn)稀釋度。

所需材料（試劑盒未提供）

1）純化水（蒸餾水或去離子水）

2）干凈的250或500mL洗瓶

3）洗浴池

4）試管

5）精密移液器：100μL

6）24x50mmm蓋玻片

7）熒光顯微鏡（具有FITC（最大激發(fā)波長(zhǎng)490 nm，平均發(fā)射波長(zhǎng)530 nm）和400倍放大倍數(shù)）

8）37℃水浴鍋或培養(yǎng)箱

9）濕盒

儲(chǔ)存與處理

試劑盒儲(chǔ)存于2-8℃，使用前于先將試劑盒平衡至室溫（20-25℃）后,再打開瓶蓋或封片

樣本收集

先將全血放置凝結(jié)后再離心分離血清，轉(zhuǎn)移到一個(gè)無菌的密封容器，儲(chǔ)存于2-8℃，如果血清樣本保存時(shí)間超過5天,需置于-20℃或更低保存，急性期樣本，立即采集；恢復(fù)期樣本，需每隔2周或4周，采血一次，觀察滴度變化。

樣品和試劑的準(zhǔn)備

洗滌緩沖液的準(zhǔn)備

加PBS包裝組分于1L的純化水中,混勻.

篩查稀釋液

首先，用稀釋液1:16稀釋血清樣本，混合均勻后至少反應(yīng)5分鐘，然后高速離心以除去聚集的IgG；取10μL上清液，加入30μL洗滌緩沖液，混合均勻，得到最終稀釋度為1:64的篩查稀釋液

實(shí)驗(yàn)步驟

1）用洗滌緩沖液連續(xù)2倍稀釋陽(yáng)性質(zhì)控品，包括一份高于和一份低于終點(diǎn)滴度（1:512）的稀釋度，所有提供的質(zhì)控品均已1:64預(yù)稀釋

2）將10μL稀釋后的血清加入相應(yīng)的孔中并標(biāo)記，將上述制備的所有陽(yáng)性質(zhì)控品以及1滴陰性質(zhì)控品加入相應(yīng)的孔中，樣本應(yīng)加至孔的頂部或底部，避免加至含抗原微點(diǎn)的中部

3）將載玻片放入濕盒中，并在37℃下孵育30分鐘

4）棄去孔中內(nèi)容物，用洗瓶輕輕沖洗孔，一次沖洗1排，以避免樣本混合，然后將載玻片浸泡在含有PBS的容器中至少5分鐘

5）在蒸餾水中短暫浸泡后晾干

6）每孔加入1滴共軛物，將載玻片放入濕盒中，在37℃下孵育30分鐘，孵育期間應(yīng)避光

7）重復(fù)洗滌步驟

8）每孔加入1-3滴封固劑，并蓋上蓋玻片

9）在熒光顯微鏡下放大400倍觀察結(jié)果，并與陰性和陽(yáng)性對(duì)照孔進(jìn)行比較，載玻片可在2-8℃下避光保存24小時(shí)

質(zhì)控說明

每次檢測(cè)都要設(shè)陰性對(duì)照和稀釋陽(yáng)性對(duì)照。陰性對(duì)照顯示陰性樣本的顯色情況，沒有明顯的立克次體體染色特征。陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)該在1:256至1:1024之間有最大終點(diǎn)稀釋（即4-16倍的瓶?jī)?nèi)陽(yáng)性對(duì)照的稀釋度）。1:512稀釋度的熒光強(qiáng)度可以作為臨界(Cut-off)進(jìn)行判讀。如果對(duì)照品的顯色情況與上述描述不符，檢測(cè)結(jié)果應(yīng)視為無效。應(yīng)該重新檢查試劑組分和操作步驟，重新檢測(cè)。

結(jié)果判定

陽(yáng)性反應(yīng)孔內(nèi)會(huì)清晰地顯現(xiàn)明亮的（至少1+）染色多形短棒狀形態(tài)，通過與陽(yáng)性質(zhì)控和陰性質(zhì)控比較大小,外觀和熒光強(qiáng)度等,各種形態(tài)都和陽(yáng)性質(zhì)控明顯不同的則判定為非特異性反應(yīng).

初次感染時(shí)，(IFA)免疫熒光檢測(cè)IgG和IgM檢測(cè)結(jié)果都迅速上升。IgM在發(fā)病的第三周達(dá)到高峰，并持續(xù)2-3個(gè)月陽(yáng)性。IgG在發(fā)病7-12周時(shí)達(dá)到高峰，之后緩慢下降，但下降速度比IgM水平慢得多，最終持續(xù)大約12個(gè)月陽(yáng)性。

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