BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi 表達載體試劑盒兼具了傳統(tǒng) RNAi 載體的優(yōu)勢（穩(wěn)定表達和使用病毒遞送的能力）與組織特異性表達和同一轉錄本中多次靶標基因敲低能力。包括在 BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi 表達載體試劑盒中的 pcDNA™6.2-GW/miR 載體設計用于表達人工 miRNA，其經(jīng)基因工程改造后與靶序列具有 99% 同源性，將導致靶標切割。該載體包括來自內(nèi)源性 miRNA 的側翼和環(huán)序列，其指導從較長的 Pol II 轉錄本（miRNA 前體）中切除基因工程改造 miRNA。使用 Invitrogen 優(yōu)質(zhì) BLOCK-iT™ RNAi Designer，70% 以上的構建體產(chǎn)生超過 70% 的敲低?；蚬こ谈脑?miRNA 的 Pol II 表達可實現(xiàn)：
o CMV 立即早期啟動子的強表達，可選擇通過 MultiSite Gateway™ 重組使用組織特異性或其他調(diào)節(jié)啟動子
o 與許多用于基因表達的 Invitrogen Gateway™ 目的 (DEST) 載體兼容；包括用于穩(wěn)定轉導分裂、非分裂和原代細胞類型的慢病毒載體、用于單位點染色體整合的 Flp-In™ 系統(tǒng)以及替代報告基因融合構建體
o 在同一轉錄本上表達一個以上的基因工程改造 miRNA，允許同時敲低多個基因并產(chǎn)生合成表型
工作原理
對于 miR RNAi 序列的高水平表達，pcDNA™6.2-GW/miR 載體包括 CMV 啟動子（圖1）。只需在免費的在線 BLOCK-iT™ RNAi Designer 中輸入 RefSeq 登錄號或核苷酸序列，該軟件即可設計出與目標靶標具有 99% 同源性的優(yōu)化 miRNA。使用快速連接方案將 miRNA 克隆至載體中并進行轉染，以立即表達 miRNA。表達的 miRNA 在細胞核中通過內(nèi)源性細胞機制（包括 Drosha）加工，然后轉運至細胞質(zhì)中，在細胞質(zhì)中通過 Dicer 進行進一步加工（圖2）。然后將加工的 miRNA 摻入 RISC 中，在后者中其功能類似于 siRNA，并可導致 mRNA 靶標切割。
對于多種表達選項，miRNA 盒（miR 側翼區(qū)和與目標靶標同源的 miRNA）可輕松地轉移至多種 DEST 載體中。這通過 Gateway™ 重組反應發(fā)生，在該反應中，將 miRNA 盒轉移至 pDONR™ 載體中（BP 反應），然后轉移至 DEST 載體中（LR 反應）。