斑馬魚(yú)CRISPR基因編輯技術(shù)服務(wù)，含基因敲入品系制備、基因敲入品系制備、轉(zhuǎn)基因品系制備等。

斑馬魚(yú)基因敲入品系制備

服務(wù)簡(jiǎn)介：

1. 基因敲入(Knock in)

非同源依賴(lài)的DNA修復(fù)技術(shù)，在斑馬魚(yú)基因組定點(diǎn)插入外源DNA片段（熒光蛋白、PA等）。

2. 基因敲入技術(shù)特點(diǎn)

   2.1 定點(diǎn)插入；

   2.2敲入效率較低。

服務(wù)流程：

根據(jù)客戶(hù)基因敲入要求進(jìn)行基因分析；

cas9 mRNA和多個(gè)gRNA靶點(diǎn)的設(shè)計(jì)及合成；

高效gRNA靶點(diǎn)的篩選及效率驗(yàn)證；

敲入載體設(shè)計(jì)及構(gòu)建；

斑馬魚(yú)胚胎的顯微注射和敲入驗(yàn)證；

F0代斑馬魚(yú)的可遺傳性篩選；

雜合子F1代斑馬魚(yú)的基因型鑒定。

環(huán)特生物優(yōu)勢(shì)：

斑馬魚(yú)敲入技術(shù)以及上百例的成功經(jīng)驗(yàn)；

*的高效篩選方法。

案例展示：

斑馬魚(yú)基因敲除品系制備

服務(wù)簡(jiǎn)介

1.基因敲除(Gene Knockout)

根據(jù)給定GeneID或Gene name，分析基因保守結(jié)構(gòu)域，在保守結(jié)構(gòu)域或客戶(hù)區(qū)域設(shè)計(jì)靶點(diǎn)并制備靶點(diǎn)gRNA，gRNA和Cas9共注射使基因產(chǎn)生移碼突變，通過(guò)PCR篩選得到穩(wěn)定遺傳品系。

2. 基因敲除技術(shù)特點(diǎn)

   2.1 通過(guò)將基因敲除斑馬魚(yú)品系與野生型相比較，研究者可以揭示特定基因的功能。

   2.2 在基因組水平上將目標(biāo)基因敲除，遺傳背景干凈清晰，是研究基因功能的金標(biāo)準(zhǔn)。

服務(wù)流程

▲根據(jù)客戶(hù)提供的GeneID或Gene name進(jìn)行基因分析——▲cas9 mRNA和多個(gè)gRNA靶點(diǎn)的設(shè)計(jì)及合成——▲高效gRNA靶點(diǎn)的篩選及效率驗(yàn)證——▲F0代斑馬魚(yú)的可遺傳性篩選——▲雜合子F1代斑馬魚(yú)的基因型鑒定

環(huán)特生物優(yōu)勢(shì)

成熟的基因敲除技術(shù)快速獲得穩(wěn)定品系；

多靶點(diǎn)共注射F0代驗(yàn)證基因功能。

斑馬魚(yú)敲除品系成功案例

1、基因分析

分析目的基因的保守結(jié)構(gòu)域；

2、靶點(diǎn)篩選

設(shè)計(jì)4個(gè)gRNA靶點(diǎn)，PCR檢測(cè)包含靶點(diǎn)的區(qū)域真實(shí)序列，顯微注射驗(yàn)證靶點(diǎn)效率；

3、大規(guī)模注射養(yǎng)殖F0

Cas9 pro+gRNA 共注射，共養(yǎng)殖 F0 約 80 條用于后期Founder篩選；

4、Founder 篩選

F0代斑馬魚(yú)與野生型外交，收集48hpf的F1胚胎抽取基因組，PCR鑒定，測(cè)序結(jié)果在靶點(diǎn)位置出現(xiàn)雙峰的認(rèn)為產(chǎn)生突變，然后TA clone驗(yàn)證其可能產(chǎn)生的突變方式；

5、F1 代篩選

F1代斑馬魚(yú)剪尾篩選，TA clone驗(yàn)證突變方式：

通過(guò)對(duì)測(cè)序圖譜的分析獲得突變方式為：-5bp，產(chǎn)生移碼突變的敲除斑馬魚(yú)；

通過(guò)對(duì)測(cè)序圖譜的分析獲得突變方式為：-4-3bp，產(chǎn)生移碼突變的敲除斑馬魚(yú)模型。

斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)基因品系制備

服務(wù)簡(jiǎn)介

1. 轉(zhuǎn)基因

斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)基因技術(shù)包括顯微注射、電穿孔技術(shù)（電脈沖介導(dǎo)）、jingzi載體法、GAL4/UAS 轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)、Tol2轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)、擬型反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)、重組桿狀病毒介導(dǎo)等方法。

2. 轉(zhuǎn)基因技術(shù)目的

   2.1 通過(guò)定點(diǎn)敲除技術(shù)進(jìn)行基因鑒定和功能研究；

   2.2 利用報(bào)告基因?qū)κ荏w等蛋白質(zhì)進(jìn)行功能研究；

   2.3 構(gòu)建各種斑馬魚(yú)突變體，通過(guò)斑馬魚(yú)疾病模型進(jìn)行人類(lèi)疾病研究和藥物篩選；

   2.4 構(gòu)建含有特異性啟動(dòng)子的生物感應(yīng)器，用于環(huán)境監(jiān)測(cè)。

3. Tol2轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)優(yōu)點(diǎn)

   3.1 Tol2轉(zhuǎn)座子可攜帶大片段DNA；

   3.2 Tol2轉(zhuǎn)座子沒(méi)有位置偏好性，幾乎能整合到染色體的任意位置；

   3.3 Tol2轉(zhuǎn)座子的耐受范圍很廣；

   3.4 Tol2作為天然的具有自主轉(zhuǎn)座活性的脊椎動(dòng)物轉(zhuǎn)座子，能夠在胚胎發(fā)育的不同時(shí)期進(jìn)行有效的轉(zhuǎn)移；

   3.5 Tol2轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)能夠有效克服外源基因在后代傳遞頻率低的技術(shù)難題。

服務(wù)流程

▲客戶(hù)提出轉(zhuǎn)基因品系制備需求→▲分析可行性→▲構(gòu)建載體→▲斑馬魚(yú)胚胎注射→▲founder篩選→▲F1代斑馬魚(yú)養(yǎng)殖→▲F2代斑馬魚(yú)養(yǎng)殖

環(huán)特生物優(yōu)勢(shì)

1.*的養(yǎng)殖方法可縮短服務(wù)周期；

2.豐富的經(jīng)驗(yàn)和及時(shí)溝通助力科研實(shí)驗(yàn)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 劉麗麗, 王健, 王海勝,等. 斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)基因平臺(tái)的建立[J]. 生物技術(shù)通報(bào), 2013(010):120-126.

[2] 陶然, 常玉梅, 李世國(guó),等. Tol2轉(zhuǎn)座子的特性及其在轉(zhuǎn)基因魚(yú)類(lèi)中的應(yīng)用[J]. 水產(chǎn)學(xué)雜志, 2014, 000(001):60-64.