熒光定量檢測試劑【用法與判定】

1用法

1.1樣品處理及模板準(zhǔn)備

1.1.1樣品處理

·組織樣品處理：分別從豬肉組織、淋巴結(jié)、脾臟不同位置取樣，用手術(shù)剪剪碎混勻后取0.1g于研磨器中研磨，加入1.5ml生理鹽水繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至1.5ml無菌離心管，12000 r/min離心2分鐘，取上清200μl備用。

·血液樣品無需處理，取200μl備用。

1.1.2模板準(zhǔn)備

·根據(jù)不同的樣本類型，按照下表準(zhǔn)備相應(yīng)的樣本用量。

·將樣本加入到1.5 ml離心管中，加入下表*體積的Solution A，渦旋震蕩20 s，并按照下表*的處理方法，室溫靜置3-5 min，或95℃金屬浴振蕩孵育3-5 min。

·樣本充分裂解后（95℃金屬浴振蕩孵育的樣本需恢復(fù)室溫），加入下表*體積的Solution B，并渦旋震蕩30 s，12000rpm離心2min，上清即為模板DNA。

·處理后的樣本如在2小時(shí)內(nèi)進(jìn)行下一步試驗(yàn)，請于4℃保存，如不能立即進(jìn)行下一步試驗(yàn)，請于-20℃保存。

備注：組織樣本加入10倍體積的生理鹽水制成組織勻漿液后，可按照血液樣本的處理方法進(jìn)行處理。

1.1.3可利用商品化試劑盒提取核酸進(jìn)行反應(yīng)，效果更佳

1.2熒光PCR擴(kuò)增

1.2.1試劑準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)前20分鐘將試劑從冰箱取出并恢復(fù)至室溫，使其*融化，充分混勻后瞬時(shí)離心去除管壁吸附液體。

1.2.2配制反應(yīng)體系

按下表1體系，在配套PCR管中配制反應(yīng)體系，蓋緊管蓋后瞬時(shí)離心10秒，轉(zhuǎn)移至擴(kuò)增區(qū)。

表1 PCR反應(yīng)體系

1.2.3 PCR擴(kuò)增

快速模式

表2儀器PCR擴(kuò)增參數(shù)

2判定

2.1合理調(diào)整閾值線，不同儀器可根據(jù)儀器噪音情況進(jìn)行調(diào)整。

2.2試劑盒有效性判定

·陰性對照：無Ct值，線形為直線或微斜，無明顯指數(shù)增長。

·陽性對照：Ct值≤30，有明顯指數(shù)增長，呈典型的S型曲線。

2.3樣本結(jié)果判定

·樣本檢測結(jié)果Ct值≤38，有明顯指數(shù)增長，判定為陽性，表明樣本中檢測出非洲豬瘟病毒。

·樣本檢測結(jié)果38＜Ct≤40，判定為可疑。應(yīng)對樣本進(jìn)行復(fù)測，若復(fù)測結(jié)果Ct值仍在38~40之間，有明顯指數(shù)增長，則判定為陽性，否則為陰性。

·樣本檢測結(jié)果無Ct值，判定為陰性，表明樣本中未檢測出非洲豬瘟病毒。

熒光定量檢測試劑